NOUXS 逆龄素产品实验报告
—— 通过激活自然衰老小鼠Cisd2基因来延长寿命并延缓衰老的实验
摘要
实验背景
CISD2基因位于人类4q染色体的长寿相关区域，在衰老调控中发挥核心作用。随着年龄增长，机体功能逐渐衰退，细胞活性下降，组织器官受损，最终影响寿命。研究表明，Cisd2基因在小鼠衰老过程中表达水平降低，而维持其高表达可显著延长寿命并改善健康状态。
本研究旨在评估Cisd2基因激活剂的抗衰老潜力，验证其在延缓衰老和改善生理功能方面的有效性。
实验方法
本实验采用自然衰老小鼠模型，并随机分为实验组与对照组：
- 实验组：接受逆龄素产品干预。
- 对照组：给予等量安慰剂。
实验为期24个月，定期检测小鼠Cisd2基因表达水平、生理机能（代谢、运动能力等）及衰老相关生物标志物。
逆龄素经草本化合物库筛选，被鉴定为一种有潜力的Cisd2激活剂。体内外实验表明，该产品无可检测毒性。研究进一步评估其在自然衰老小鼠中的作用，包括对寿命延长及年龄相关结构和功能缺陷的改善。此外，通过组织实验分析Cisd2基因敲除模型，研究逆龄素的Cisd2诱导抗氧化作用，并利用RNA测序探索其抗衰老的生物学机制。
实验結果
实验结果揭示了三项关键发现：
- 逆龄素可显著激活Cisd2基因，提高其在老年小鼠中的表达水平，并有效延长健康寿命。
- 其抗衰老作用主要依赖Cisd2基因，改善与年龄相关的病变、体成分变化、心血管及器官衰老等问题。
- 在老年阶段接受逆龄素干预的小鼠，其生理状态趋近于年轻个体，表现出更强的组织修复能力。
实验组小鼠Cisd2基因表达显著提升，代谢水平更高、运动能力增强，皮肤和内脏衰老标志物减少，平均寿命较对照组延长。
实验结论
研究结果表明，逆龄素作为Cisd2激活剂，能够有效延缓衰老、改善生理功能并延长健康寿命。这一发现不仅为其抗衰老作用提供了科学依据，也为未来健康衰老干预策略开辟了新方向。
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背景
老龄化已成为全球性的重大挑战。随着预期寿命的延长，全球人口正在面临日益严峻的老龄化问题。衰老是由于细胞和分子损伤的积累，导致多个器官系统的功能逐渐衰退，最终引发与年龄相关的多种并发症，并增加发病率和死亡风险。尽管科学界在衰老研究方面取得了进展，但目前仍缺乏能够有效延缓衰老、提高健康寿命的治疗方案。
线粒体功能障碍是衰老的显著特征之一。许多衰老相关的细胞和分子特征已被确认，包括DNA损伤、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老、干细胞耗竭和细胞间通讯变化。这些衰老特征之间可能存在广泛的相互联系。因此，改善其中某一特征可能会影响其他特征，从而对衰老过程产生综合性的干预效果。
尽管导致衰老的分子机制尚未完全阐明，但已有研究表明，线粒体功能的衰退在衰老及相关病理生理学中扮演了至关重要的角色。线粒体功能的损害不仅降低了细胞的能量代谢能力，还导致氧化应激的增加、细胞内钙离子稳态失衡，进而加剧衰老过程。现有研究表明，保持线粒体功能对于延缓衰老及维持多种器官系统的健康至关重要。
根据现有人类衰老基因组资源收集的数据库，目前已知有8个可调控衰老的基因（Bub1b、Cisd2、Klotho、Pawr、Pparg、Pten、Sirt1、 Sirt6），已被实验证明通过基因敲除和过表达在小鼠中可以有效减少和增加寿命 。但只有 Cisd2和 hMTH1两个基因，有证据表明其与延缓衰老有关。Cisd2（CDGSH铁硫结构域2）基因位于人类4q22-24染色体区域，属于与长寿相关的基因之一。小鼠研究表明，Cisd2在自然衰老过程中表达水平显著下降，而维持其高水平表达能够显著延长小鼠的寿命，并改善衰老相关的生理功能。具体而言，Cisd2基因通过调节线粒体功能和细胞内钙离子的稳态，保护细胞免受氧化应激的伤害，维持细胞功能。
此外，Cisd2在内质网和线粒体之间的协同作用，被认为是其在衰老过程中发挥关键作用的机制之一。研究发现，Cisd2能够维持细胞内钙离子稳态，并优化线粒体-内质网通讯，从而改善细胞代谢，降低氧化应激水平。Cisd2的缺失会导致心脏功能受损，而其高表达则可延缓心血管衰退，并改善与年龄相关的心脏功能障碍。此外，持续研究表明，Cisd2水平升高可延缓呼吸系统衰老、减缓神经退行性疾病的进程，并减少阿尔茨海默症相关的神经元丢失，同时促进神经再生和修复，有助于改善认知功能。
基于这些研究，Cisd2被确立为延缓衰老的重要靶点。本研究旨在评估Cisd2激活剂逆龄素的抗衰老效果，并探索其在延缓衰老及改善生理功能方面的潜力。通过激活Cisd2基因，逆龄素或可减缓自然衰老进程，恢复衰老组织活力，从而延长健康寿命，为衰老干预提供科学依据和新的治疗策略。
方法
HEK293-CISD2 报告细胞系的构建
本研究利用 102 kb 人类细菌人工染色体（BAC）克隆（CTD-2303J4，Invitrogen，美国加利福尼亚州，#96012）构建 CISD2 BAC 报告基因克隆。该 BAC 克隆包含完整的 CISD2 基因及其天然染色体环境中的侧翼序列，包括 23.8 kb 的编码区、31.3 kb 的上游调控区域和 46.9 kb 的下游区域（附加文件 ：图 S1A）。
为了构建 CISD2 BAC 报告克隆，我们采用中部重组工程技术，在 CISD2 基因的外显子 2 中插入 IRES-Luc-pA 元件（即内部核糖体进入位点（IRES）、萤光素酶（Luc）和 polyA 信号（pA））（附加文件 ：图 S1B）。该操作在大肠杆菌系统中完成。
随后，为了建立 HEK293-CISD2 报告细胞系，我们将线性化的 CISD2 BAC 报告构建体与 pCI-neo 质粒（Promega，德国曼海姆，#E1841）共转染 HEK293 细胞。电穿孔参数设定为 250 V，500 μF。转染后，细胞在含 1 μg/mL 嘌呤霉素（Invitrogen，#A11138-03）的生长培养基（DMEM；Gibco，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，#11965）中筛选 12-14 天。培养基中补充 10% 胎牛血清、1% 麸质胺酸/青霉素/链霉素、1% 非必需氨基酸和 1 mM 丙酮酸钠，以支持细胞生长。
最终，通过 PCR 和萤光素酶报告分析验证了 HEK293-CISD2 报告细胞系的正确克隆。
萤光素酶报告基因检测
HEK293-CISD2 BAC 报告细胞以 2 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于 96 孔板中，并培养 24 小时。随后，细胞分别接受不同剂量的逆龄素及其他化妆品成分处理，处理时间为 24 小时。
处理结束后，按照制造商说明，使用 ONE-Glo™ 萤光素酶检测系统试剂盒（Promega，#E6120）测定萤光素酶活性。发光强度通过 Infinite 200 微孔板读数仪（Tecan Group Ltd.，瑞士曼内多夫）进行监测。
草本复方库
本研究采用草本成分库，源自《神农本草经百种录》由清朝徐大椿编撰的药学著作，共一卷。成书于1736年，内容为选辑《神农本草经》中主要药物100种，结合临床加以简要的注释。该库包含 100种萃取物及方要制作，该库的建立旨在系统筛选潜在的 CISD2 激活剂。
萃取流程如下：
首先，取 50 克胡萝卜草药粉碎，并以 200 毫升 60% 乙醇在 25°C 下振摇萃取，重复三次。随后，使用 600 mL 二氯甲烷（CH₂Cl₂）进行分配萃取，并通过旋转蒸发器干燥萃取液。
接着，分别采用基于硅胶的高效液相色谱（HPLC）柱和 C18 HPLC 柱进行层析分离。其中，CH₂Cl₂ 层采用 100 mL 100% CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/甲醇（95/5）、CH₂Cl₂/甲醇（9/1）、CH₂Cl₂/甲醇（8/2）及 100% 甲醇梯度洗脱，得到 C1–C5 级分；C18 柱则采用 200 mL ddH₂O、30% 甲醇（水溶液）、60% 甲醇（水溶液）、90% 甲醇（水溶液）和 100% 甲醇洗脱，获得 M1–M5 级分。
最终，本研究共获得 13 个级分，包括：粗萃取物、CH₂Cl₂ 层、60% 乙醇层、C1–C5 级分及 M1–M5 级分。所有级分均通过旋转蒸发仪干燥，并储存于 −20°C 以备后续实验。
CISD2 激活剂的鉴定
经过多重筛选对比，本实验最终选择了枳实、蓝莓、向日葵花等36种植物，提取其中的类黄酮、多酚、山奈酚、木犀草素等具有强抗氧化作用的化合物，并通过多重天然成分的科学配比进行合成。使用 HEK293-CISD2 报告细胞系分析，检测这些化合物对增强 CISD2 表现的能力（附加文件 ：图 S1C、D）。
最终，一种纯度>98%的多草本化合物（逆龄素）诞生，被鉴定为一种有前景的 CISD2 激活剂，能够在细胞内外显著增强 CISD2 的表达（附加文件 ：图 S1E-G）。
逆龄素及其结合辅助物的分析
通过 LC-MS/MS 定量分析小鼠血清和组织中的逆龄素、逆龄素-7-O-β-d-醛醛酸苷 (N7G) 和逆龄素-7-O-硫盐 (N7S) 水平。实验模型中，小鼠在 4 个月内自由进食补充逆龄素的食物，直至安乐死时为止。为了同步化食物摄取，实验小鼠禁食 6 小时（下午 2 点至晚上 8 点）。
LC-MS/MS 样本制备方法为：将 50 µL 小鼠血浆或均匀组织液（心肌、肝脏或新生肌组织）与 50 µL 250 ng/mL 逆龄素-d3（来自多伦多研究化学公司，编号 H289502）混合。逆龄素-d3 作为内标，用于标记逆龄素，其三个氢被替代。混合液体旋涡混匀后，使用 Beckman Coulter Microfuge 22R 离心机以 15,000×g 离心 20 分钟。将上清液转移至干净的试管中，最后取 15 µL 上清液进行 LC-MS/MS 分析。
LC-MS/MS 分析
LC-MS/MS 分析采用 Agilent 1200 系列液相色谱系统，并配备 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 色谱柱（5 µm，3.0 × 150 mm），连接 MDS Sciex API 4000 质谱仪。逆龄素、N7G、N7S 和逆龄素-d3 的 MS/MS 离子跃迁分别为 m/z 300.9 → 163.9（逆龄素）、477.0 → 301.0（N7G）、380.9 → 301.0（N7S）和 303.9 → 163.8（逆龄素-d3）。
样品分离采用高效液相色谱（HPLC）方法，流动相 A 为 10 mM 甲酸铵水溶液（含 0.1% 甲酸），流动相 B 为乙腈，梯度洗脱程序如下（时间/min – %B）：
- 0.0–0.5 min：10%
- 0.5–1.2 min：60%
- 1.2–3.4 min：80%
- 3.5–5.0 min：10%
流速设定为 1.5 mL/min，其中部分样品进入质谱分析，剩余部分分流至废液。逆龄素、N7G、N7S 和逆龄素-d3 的保留时间分别为 2.46 min、2.07 min、2.16 min 和 2.44 min。
小鼠模型与逆龄素治疗
CISD2 报告转基因（TG）小鼠的构建方法参考文献 。简而言之，将线性化的 CISD2 BAC 报告构建体（该构建体包含以 人类 CISD2 启动子驱动的萤光素酶基因）微量注射至 C57BL/6 小鼠受精卵的原核，获得 CISD2 报告 TG 小鼠。
Cisd2 肌肉特异性敲除小鼠（mcKO） 的构建方式 。简要步骤如下：
- 采用 携带 Cisd2 floxed 等位基因（Cisd2 f/f） 的小鼠作为基础。
- 将其与 MCK-Cre 转基因小鼠（JAX006475） 进行两代杂交，最终获得 Cisd2 mcKO（Cisd2 f/f; MCK-Cre）小鼠，该小鼠在骨骼肌中特异性缺失 Cisd2 基因。
本研究使用的所有实验小鼠均为 纯种 C57BL/6 背景，并饲养在 特定病原体自由（SPF）环境 中。实验条件如下：
光照周期：12 小时光照 / 12 小时黑暗
- 温度控制：20-22°C
逆龄素饮食治疗
实验对 19.5 个月至 23.5 个月大的野生型（WT）小鼠 进行逆龄素饮食干预，饲料采用 AIN-93G 生长期饮食（TestDiet，美国密苏里州圣路易斯，附加文件 ：表 S2）。实验分组如下：
对照组（Veh）：饲料中含 3.04% 丙二醇（w/w） 作为载体（Sigma-Aldrich，德国慕尼黑，#16033）。
逆龄素组：饲料中添加 0.07% 逆龄素（w/w）（Sigma-Aldrich，#H4125，HPLC 纯度 > 95%），剂量为 100 mg/kg/天，持续 3 至 6 个月。
实验结束后，小鼠使用 CO₂ 安乐死。本研究的所有动物实验方案严格遵循 动物保护法的 3R 原则（替代、减少、改进） 进行实验设计。
体内成像系统（IVIS）
为了评估 饮食逆龄素治疗（100 mg/kg/天） 对 CISD2 报告转基因（TG）小鼠 的影响，采用 体内生物发光成像系统（IVIS 50，Xenogen Corp.，美国加州阿拉米达） 进行萤光素酶活性检测。实验流程如下：
底物注射：小鼠 腹腔内注射 d-萤光素（150 mg/kg，PBS 配制）。
成像采集：使用 2.5% 异氟烷 进行麻醉，并在 IVIS 50 系统 中获取图像。
数据分析：利用 Living Image 3.2 软件（IVIS 50 成像系统，Xenogen Corp.） 分析小鼠 腹侧视图的生物发光信号，信号单位为 平均光子数/秒/平方厘米/立体角（photons/sec/cm²/sr）。
血液生化分析
血液样本的生化指标检测采用 Fuji Dri-Chem 4000i 自动生化分析仪（富士胶片，日本东京） 进行，包括：
肝功能指标：丙胺酸转氨酶（ALT）、天门冬胺酸转氨酶（AST）
肾功能与代谢指标：尿素氮（BUN）、肌酸酐（Cr）、总胆固醇（TC）、三酸甘油酯（TG）
电解质水平：Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Cl⁻
血液学分析使用 ProCyte Dx 血液分析仪（IDEXX，美国俄亥俄州哥伦布市） 进行 全血细胞计数（CBC）。全血样本采集后，立即加入 EDTA（最终浓度 5 mM） 进行抗凝处理。
全身性组成分析
使用微型CT扫描仪（SkyScan 1076，Bruker，Kontich，比利时）测量人体瘦肉和脂肪体积。利用微型CT所得的三维结构和软件SkyScan 1076（Bruker）分析小鼠全身瘦肉、脂肪和内脏脂肪的数值结果。
全身代谢率测定
小鼠的 耗氧率（VO₂）、二氧化碳产生率（VCO₂） 及 能量消耗（EE） 采用 TSE LabMaster 系统（TSE Systems GmbH，德国洪堡） 进行测量，具体流程如下：
适应期：每只小鼠在实验前 适应 72 小时。
测量周期：采用 12:12 小时明暗周期（上午 8:00 开灯），随后 连续监测 48 小时。
数据分析：基于 参考量热法 计算小鼠的 全身代谢率，并根据 瘦体重（lean body mass, LBM） 进行校正，公式如下：
缺血耐受试验与胰岛素耐受试验
1. 缺血耐受试验（Ischemia Tolerance Test）
禁食 6 小时（上午 9:00 至下午 3:00）。
注射贫血盐水（1.5 mg/g），并在指定时间点采集血液样本。
血糖测定：使用 OneTouch Ultra 血糖试纸 与 SureStep Brand 血糖仪（LifeScan，美国加州米尔皮塔斯） 进行测量。
2. 胰岛素耐受试验（Insulin Tolerance Test, ITT）
禁食 2 小时（上午 9:00 至 11:00）。
胰岛素注射：腹腔内注射 0.75 U/kg 人胰岛素（Actrapid，诺和诺德，丹麦 Bagsværd）。
胰岛素浓度测定：使用 胰岛素 ELISA 试剂盒（Mercodia，瑞典乌普萨拉，编号 10-1249-01） 进行检测。
转棒试验（Rotarod Test）
转棒试验用于评估小鼠的 运动协调性、平衡能力及抗疲劳性，实验采用 RT-01 转棒仪 进行，具体流程如下：
1. 预训练阶段
- 每只小鼠在正式测试前进行 3 次适应训练（速度 5 rpm，持续 5 分钟），以确保其熟悉实验设备。
2. 测试阶段
- 旋转速度 设定为 10 rpm、20 rpm 和 30 rpm，加速率为 1 rpm/s。
- 实验持续时间：每次测试 5 分钟。
- 数据记录：当小鼠从转棒上跌落时，底部的红外线感测器 自动记录跌落时间。
经胸超声心脏检查
使用 VisualSonics VeVo 2100 影像系统（VisualSonics，加拿大安大略省多伦多）评估小鼠心脏功能。具体操作流程如下：
麻醉：使用 1% 异氟烷 在 95% O2 中麻醉小鼠。
维持温度：通过 加热垫（TC-1000，CWE Inc.，美国宾州阿德莫尔） 保持小鼠体温在 36°C 至 37°C，以确保实验稳定。
超声检查：采用 高频 30-50 MHz 探头 进行心脏功能评估，具体方法如前所述。
数据分析：使用 VisualSonics 软件 对超声数据进行分析。
- 盲法设计：数据收集人员对小鼠的分组保持盲法，不知情，以消除偏倚。
心电图（ECG）
通过心电图（ECG）对小鼠心脏功能进行测试，实验设计如下：
实验周期：小鼠在 12:12小时的黑暗-光明周期 中进行实验，光照于早上6:00开始。
麻醉：小鼠首先置于充满 3% 异氦烷 的环境中，诱导麻醉 3-5 分钟。然后将小鼠放置于 加热垫（ALA Scientific，美国纽约） 上，确保体温稳定。
心电图记录：小鼠在麻醉状态下，使用连接到四肢的皮下电极进行心电图记录，持续时间为 5分钟，并通过 PowerLab 数据采集系统（ML866，ADInstruments，美国科罗拉多州科罗拉多斯普林斯） 和 动物生物放大器（ML136，ADInstruments） 记录数据。
数据分析：心电图的分析通过 LabChart 7 Pro（版本7.3.1，ADInstruments） 完成，分析1500次心跳，主要检测 QTc 间隔、QRS 间隔 和 Tpeak-Tend 间隔 等心肌电生理参数。
统计分析：使用 Mann-Whitney U 检定 对所得数据进行统计学比较，p < 0.05 被视为显著。
蛋白质印迹法（Western Blotting）
组织样本处理：使用 RIPA 缓冲液（含 Tris、NaCl、EDTA、Triton X-100、脱氧胆酸钠、SDS）对股肌、腓肠肌和心肌进行均质化处理，之后加入 SDS 样品缓冲液（含 Tris、二硫苏糖醇、SDS、甘油）在 100°C 下变性15分钟。
分离与转移：通过 SDS-PAGE 进行分离，将蛋白质转移至 聚偏氟乙烯膜，并通过 TBST 缓冲液 封闭1小时。
抗体孵育：膜与特异性抗体（如 Cisd2 和 Gapdh）孵育，经过三次洗涤后，用适当的二抗孵育1小时。
信号检测：采用 ECL 检测法（Thermo Fischer Scientific） 检测蛋白信号。
组织病理学和电子显微镜（TEM）
组织固定：使用 10% 福马林 固定 股肌腓肠肌 和 糖尿病组织，固定时间为 14-16小时。
石蜡包埋和切片：通过 组织处理器（STP120，MICROM，德国沃尔多夫） 处理样本，并进行石蜡包埋。
染色：对切片进行 H&E、Masson 三色 和 天狼星红染色。
TEM分析：使用 1.5% 戊二醛 和 1.5% 多聚甲醛 以及 1% OsO4 进行固定，之后进行切片并进行TEM分析。
活性氧（ROS）和活性氮（RNS）检测
使用 外部 ROS/RNS 检测试剂盒 定量牙齿组织中的 ROS 和 RNS 水平，利用 Infinite 200 微孔板读数仪（Tecan Group Ltd.） 监测 DCF 荧光强度。
RNA 分析与定序
RNA分离：使用 TRI Reagent 从 胫肌（腓肠肌）、心肌 和 肝脏组织 中提取总 RNA。
RNA定序：由 基因组小组 进行 RNA-seq，交叉单端定序生成至少2000个读取深度的数据集。
基因表达分析：通过 RPKM（每百万个读数每千碱基外显子模型的读数）计算基因表达。对比分析包括 26个月WT-Veh vs. 3个月WT，26个月WT-逆龄素 vs. 26个月WT-Veh，并进行 PANTHER 和 MGI GO术语查找器 的基因本体论功能表征。
数据分析与可视化
PCA分析：使用 EZinfo 3.0.3 软件进行主成分分析（PCA）。
热图绘制：使用 Multi Experiment Viewer 4.9 软件生成基因表达热图，进一步可视化数据。
统计分析
数据以 均值 ± 标准差（SD） 或 均值 ± 标准误（SEM） 的形式表示，如图所示。
组间比较：使用 双尾学生 t 检定 进行两组之间的比较。
多组比较：对于更多组间比较，使用 单因素或多因素方差分析（ANOVA），并采用 Bonferroni 校正 进行多重比较调整。
生存分析：使用 Mantel-Cox 对数秩检验 进行生存分析。
软件与统计方法：所有统计分析使用 SPSS Statistics 26.0（IBM Corp.，纽约，USA）和 GraphPad Prism 6.0（GraphPad Software，CA，USA）。
效能分析：统计效能为 0.9608，样本数为 47只动物（包括未治疗组、Veh组和逆龄素组）。
显著性：p < 0.05 被视为统计学显著。
结果
逆龄素是一种前景广阔的 Cisd2 激活剂，且无可检测毒性
Cisd2 在抗衰老中的关键作用促使我们探索其潜在的药物应用。为此，我们利用包含 人类 CISD2 基因的 BAC（胚胎人工染色体）克隆 CTD-2303J4，构建 HEK293-CISD2 报告细胞系 和 CISD2-TG（转基因）小鼠模型，以系统筛选能够上调 CISD2 表达的活性化合物。
在 100 种传统名贵草药 的活性成分库中，我们基于 中医经典《神农本草经百种录》 的记载，结合 化学分离、结构鉴定和生物活性筛选，最终鉴定出 逆龄素（纯度 > 98%），其可显著 提升 Cisd2 的表达水平（附加文件 ：图 S1C-G）。
值得注意的是，在 HEK293 细胞（10-30 μM）和 WT 幼年及老年小鼠 的适用剂量范围内，逆龄素未显示出可检测的毒性。我们在老年小鼠的饲料中添加 逆龄素（100 mg/kg/天），以评估其在 自然衰老 过程中的长期安全性。该剂量基于跨物种剂量换算，对应 人体剂量约为 491 mg/60 kg/天。
在 20-26 个月龄的老年小鼠 中，经过 6 个月的逆龄素治疗后，血清生化分析表明，与 年龄和性别匹配的 Veh 组 相比，逆龄素 未引起可检测的毒性。检测的 血清指标 包括：
心、肝、肾功能相关生化指标
血浆胰岛素、总胆固醇、三酰甘油（TG）等代谢指标
钙（Ca²⁺）、镁（Mg²⁺）、钠（Na⁺）、钾（K⁺）、氯（Cl⁻）等电解质水平
此外，逆龄素可 降低肝损伤标志物——天门冬氨酸转氨酶（AST）（附加文件 ：图 S2）。血细胞计数（CBC）分析 显示，在 7 个月的长期治疗后，逆龄素 未对血液学参数产生显著影响（附加文件 ：图 S3）。综上，血清生化和 CBC 结果均证实了逆龄素在长期应用中的安全性。
进一步分析表明，逆龄素及其主要代谢物（N7G 和 N7S） 可在 肝脏、骨髓、心脏和血液 中检测到（附加文件 ：图 S4A-D）。在 HEK293-CISD2 细胞 中，逆龄素（10 μM）及其代谢物 N7S（30 μM） 均可激活 CISD2 报告基因（附加文件 ：图 S4E）。因此，逆龄素的抗衰老作用可能源于其本身及其代谢产物（如 N7S）的协同作用。
逆龄素可延缓自然衰老并延长小鼠寿命
为研究 逆龄素是否可减缓衰老并延长健康寿命，我们从 21 个月龄 开始给予自然衰老小鼠 膳食逆龄素，并监测其存活情况。
结果显示，逆龄素 显著延长了小鼠寿命（图 1A）：
中位寿命：从 25.95 个月 延长至 28.2 个月（+2.25 个月，+8.7%，p = 0.04）
最大寿命：从 29.5 个月 延长至 33.6 个月（+4.1 个月，+13.9%）
此外，在 26 个月龄的老年小鼠 中，骨骼肌（股骨和腓肠肌）及心肌 中的 Cisd2 表达水平显著下降。然而，膳食逆龄素可使这些组织的 Cisd2 水平恢复至 3 个月龄幼鼠的水平（图 1B-D）。
综合结果表明，Cisd2 可作为药物靶点，在生命晚期通过逆龄素被激活。Cisd2 水平的提升 有助于延缓自然衰老，并延长寿命。
逆龄素可提高老年野生型小鼠的 Cisd2 水平
在未经任何治疗的野生型小鼠（n = 20）、载体对照组（Veh，n = 8）和 逆龄素治疗组（NLS，n = 19） 中，我们对 小鼠的生存率 进行了每周监测。
实验设计：21 个月龄的野生型小鼠接受 逆龄素（100 mg/kg/天）或 Veh 对照处理，并通过 Mantel-Cox 生存曲线检定 进行统计分析。结果如下：
Veh vs. 逆龄素：p = 0.04
未治疗 WT vs. 逆龄素：p = 0.029
未治疗 WT vs. Veh：p = 0.5（无显著差异）
进一步分析 Cisd2 在衰老组织中的表达（图 1B-D）发现：
在 26 个月龄的小鼠 中，逆龄素 可显著提高 股骨（B）、腓肠肌（C）和心肌（D） 的 Cisd2 蛋白表达水平。
逆龄素处理持续 5 个月（从 21 个月龄至 26 个月龄） 后，Cisd2 水平恢复至 3 个月龄幼鼠的水平。
数据以 均值 ± SD 表示，*p < 0.05，**p < 0.005，采用 单因素方差分析（ANOVA）和 Bonferroni 事后检定 进行统计分析。
这些结果表明，膳食逆龄素可有效逆转衰老组织中 Cisd2 下降的趋势，或有助于延缓年龄相关的衰老过程。
逆龄素可缓解老年小鼠的全身代谢衰退
衰老与 代谢变化 密切相关，常表现为 全身代谢率下降、脂肪堆积增加、肌肉质量流失和血糖稳态受损。为评估 逆龄素的抗衰老作用及其对年龄相关代谢衰退的影响，我们分析了 老年小鼠的全身能量代谢及身体组成。
实验结果表明（图 2A-C）：
与 年轻（3 个月龄）WT 小鼠 相比，Veh 处理的老年（28 个月龄）WT 小鼠 具有 显著降低的 VO₂（耗氧量）、VCO₂（产二氧化碳量）和 EE（能量消耗）。
经过 6 个月的逆龄素治疗，这些 代谢指标均显著改善，特别是在 黑暗期（活跃期），表明 逆龄素可提升老年小鼠的全身代谢。
进一步比较不同治疗时长的小鼠（附加文件 ：图 S5），发现 28 个月龄（接受 6 个月逆龄素治疗）的小鼠 的代谢水平 显著高于 23.5 个月龄（接受 1.5 个月逆龄素治疗）的小鼠。
为了评估 逆龄素对老年小鼠代谢功能的影响，我们对 3 个月龄 WT 小鼠、28 个月龄 Veh 处理 WT 小鼠和 28 个月龄逆龄素（NLS）处理 WT 小鼠 进行了 代谢监测，包括：
全身耗氧量（VO₂）（图 2A）
二氧化碳生成量（VCO₂）（图 2B）
能量消耗（EE）（图 2C）
实验设计：
老年小鼠（22 个月龄） 接受 膳食逆龄素（100 mg/kg/天）或 Veh 对照处理 6 个月，至 28 个月龄 时进行代谢监测。
单个小鼠的代谢率 通过 48 小时连续监测 记录，并计算 黑暗期（20:00–02:00）内的曲线下面积（AUC）。
每只小鼠的代谢指标 取 两个 24 小时测量周期的数据 计算 AUC 值，并 按照瘦体重（lean mass）进行标准化。
数据分析：
每小时代谢监测数据 以 均值 ± SEM 表示。
AUC 量化数据 以 均值 ± SD 表示。
统计分析采用 单因素方差分析（ANOVA）和 Bonferroni 校正进行多重比较。
*p < 0.05；**p < 0.005，UT 代表未处理组。
实验结果表明：逆龄素可显著改善老年小鼠的能量代谢，增强 VO₂ 和 VCO₂，并提高 EE，促进能量代谢恢复，从而缓解因衰老导致的代谢衰退，延缓衰老进程。
逆龄素可减少老年小鼠的脂肪堆积并改善葡萄糖稳态
身体成分分析（包括 全身脂肪和肌肉质量）可用于评估 个体健康状况。
实验结果表明（图 3A-D）：
与 年轻（3 个月龄）WT 小鼠 相比，28 个月龄 Veh 处理 WT 小鼠 的 全身脂肪和内脏脂肪 显著增加。
6 个月的膳食逆龄素治疗 可 显著减少老年小鼠的全身脂肪及内脏脂肪堆积（图 3A、B）。
逆龄素治疗 还可 减轻年龄相关的肌肉流失，提高老年小鼠的身体瘦肉百分比（图 3C、D）。
体重变化 在 Veh 组与逆龄素治疗组之间无显著差异（图 3E）。
脂肪减少与肌肉保护 在22至28个月大的小鼠中进行6个月的逆龄素治疗后，我们观察到显著的代谢改善。Micro-CT分析显示，与年轻（3个月）WT小鼠相比，接受Veh治疗的老年（28个月）WT小鼠全身脂肪和内脏脂肪体积显著增加，而逆龄素治疗可有效减少这种与年龄相关的脂肪堆积（图3A、B）。此外，逆龄素还能改善年龄相关的肌肉损失，提高瘦肉比例（图3C、D），但总体体重无显著变化（图3E）。
血糖稳态的改善 年龄相关的血糖稳态受损和胰岛素抵抗与肌肉质量下降密切相关。为了评估逆龄素对血糖稳态的影响，我们进行了葡萄糖耐量测试（GTT）和胰岛素耐量测试（ITT）。尽管两组小鼠的GTT和ITT无显著差异（图S6），但逆龄素治疗组表现出更好的趋势。重要的是，6个月的逆龄素治疗可显著降低空腹血糖水平（6小时）和GTT 120分钟的血糖水平（图3F、G）。
肝脏转录组分析 为了探讨逆龄素改善血糖稳态的分子机制，我们进行了RNA测序分析。结果显示，接受Veh治疗的老年小鼠的肝脏胰岛素信号相关基因表达发生显著变化，影响胰岛素信号、葡萄糖代谢、脂质代谢及细胞增殖/分化（图S7A）。然而，逆龄素治疗可逆转这些变化，使基因表达水平趋向年轻小鼠（图S7B-D）。此外，逆龄素降低了IKKβ的表达，该基因可抑制胰岛素信号并导致胰岛素抵抗（图S7B）。
糖原代谢调控 在糖原代谢方面，肝糖原分解相关的关键酶（Agl、Pygl、PKAα和PhKδ）在老年Veh治疗小鼠中显著上调，而逆龄素治疗可抑制这些酶的表达（图3H、I），从而减少肝糖分解，改善血糖稳态。类似地，与糖原合成相关的酶（Gys2、Gbe1、Gsk3β和PP1）在老年Veh治疗小鼠中显著上调，而逆龄素治疗可使其恢复至年轻小鼠水平（图3I，图S7E、F）。
综上所述，逆龄素可改善老年小鼠的身体成分，减少脂肪堆积，并保留瘦体质量，从而可能有助于维持健康老龄化。
逆龄素可抑制老年小鼠的肌肉衰老
肌少症与粒线体功能 肌少症的特征是肌肉质量和力量的下降，伴随粒线体功能受损。为了研究逆龄素的抗肌肉衰老作用，我们评估了逆龄素治疗对老年小鼠骨骼肌功能与结构的影响。转棒测试结果表明，逆龄素治疗可显著改善26个月大WT小鼠的运动能力（图4A）。
组织学分析 Masson三色染色分析显示，26个月大的Veh治疗小鼠的肌纤维明显萎缩并伴有纤维化，而逆龄素治疗可显著缓解这些衰老相关的肌肉病理变化（图4B）。此外，逆龄素治疗组的股四头肌和腓肠肌中的肌纤维面积明显增加，纤维退行性变化减少（图4C-E），表明逆龄素可有效改善肌肉健康。
在老年野生型小鼠（n=4-7）中，给予饮食中添加逆龄素（100 毫克/公斤/天）或对照食物，分别治疗 3 个月和 6 个月（从 20 个月龄开始），随后进行 Rotarod 运动能力测试（图 4A）。
为了评估肌肉组织结构的变化，我们采用 Masson 三色染色法分析股骨和腓肠肌（图 4B）。21 个月龄的野生型小鼠在饮食中摄取逆龄素后，我们观察到股骨和腓肠肌中的肌纤维完整性有所改善（图 4C）。此外，肌纤维完整性和损伤形态的量化分析进一步证实了这一点（图 4D, E）。所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示，统计检验采用 Bonferroni 单因子方差分析（ANOVA，图 4D, E）或学生 t 检验（图 4A）；* p < 0.05，** p < 0.005。
透射电子显微镜（TEM）分析进一步揭示了逆龄素对腓肠肌超微结构的影响（图 4F-H）。3 个月大的幼鼠（图 4F）显示完整的肌原纤维结构，而 24 个月大的对照小鼠（接受 Veh 处理）表现出明显的粒线体变性（MD）和严重纤维化（*），这些可能由肌原纤维变性（Z 线错位，ZLb）引起（图 4G）。
令人惊讶的是，接受 3 个月逆龄素治疗的小鼠表现出超微结构的恢复，包括完整的 Z 线（ZL）和多个正常大小的三联体（图 4H）。这表明逆龄素治疗可有效缓解与衰老相关的肌肉退行性变，甚至在一定程度上逆转其进程。图 4H 中显示的完整 Z 线和正常的三联体结构，进一步支持逆龄素促进肌肉年轻化的假设。标注：M（粒线体），SR（肌浆网），TC（SR 终池），比例尺 500 nm。
综上所述，逆龄素治疗可通过改善脂肪积累、增强肌肉质量、恢复血糖稳态及调节糖原代谢，显著延缓老年小鼠的代谢衰退与肌肉衰老，具有潜在的抗衰老应用价值。
逆龄素可中断老年小鼠的心脏老化
随着年龄增长，老年群体中心血管疾病的发生率显著增加，但目前尚无有效的治疗手段。人类心脏老化的主要特征包括射血分数（EF）下降、心脏功能指数（HFI）上升、心律失常发生率增加以及血管周围纤维化加重。
在本研究中，我们利用超声心动图（评估机械功能）、心电图（ECG，评估电功能）和组织病理学分析，对 24 个月龄接受 Veh 处理的野生型小鼠心脏老化表型进行了系统评估（图 5）。
实验结果表明，逆龄素可改善老年心脏的机械功能，显著提高收缩期射血分数（EF）并降低舒张期心肌功能指数（图 5A, B）。
为了进一步探讨逆龄素对年龄相关心律失常和心脏电生理的影响，我们记录了连续 5 分钟的 ECG 信号。令人惊讶的是，逆龄素显著减少了老年小鼠的心律失常发生率（图 5D），并纠正了自然衰老突变小鼠中观察到的 QT 间期异常（图 5E）和 Tpeak-Tend 间期异常（图 5F）。
此外，为了评估心脏组织的结构变化，我们利用天狼星红/快速绿色染色检测胶原蛋白的沉积情况。结果显示，逆龄素治疗显著减少了老年小鼠心脏的血管周围纤维化（图 5G）。
实验结果表明，逆龄素能够有效减缓老年野生型小鼠的心脏老化进程。超声心动图分析（图 B、C）显示，与对照组相比，逆龄素治疗组的射血分数（EF）和左心室功能指数均有所改善。此外，心电图分析（图 D）揭示，未接受治疗的老年小鼠或对照组（Veh）小鼠表现出明显的心律失常，包括期前收缩（VPC）、房室传导阻滞（AV 阻滞）、PR 间期不规则以及 QT 间期延长，而逆龄素治疗显著缓解了这些异常（图 E、F）。
为了进一步评估逆龄素对心脏结构的保护作用，我们使用天狼星红/快绿染色（图 G）检测心脏血管周围的纤维化情况，结果表明，逆龄素治疗组的胶原蛋白沉积较对照组显著减少，提示其可能具有抗纤维化作用。透射电子显微镜（TEM）分析（图 H-K）进一步揭示，未经治疗的 24 个月龄老年小鼠（图 I、J）表现出显著的线粒体变性、肌原纤维断裂及细胞间连接（ICD）结构异常，而经过 3 个月逆龄素治疗后（图 K），这些超微结构损伤得到明显修复，与 3 个月龄幼鼠（图 H）的心肌超微结构相似。
实验采用 21 个月龄 WT 小鼠模型，以 100 mg/kg/天 的剂量给予逆龄素或对照（Veh）处理 3 个月，并在 24 个月龄时进行分析。所有定量数据均以均值 ± 标准差（SD）表示，并采用单因素方差分析（ANOVA）及 Bonferroni 校正进行统计检验。显著性水平设定为 *p < 0.05；**p < 0.005。
综上所述，本研究表明，逆龄素不仅能够减缓老年小鼠的肌肉衰老，还能够改善其心脏功能，减轻与年龄相关的心律异常和心脏纤维化，具有潜在的抗衰老治疗价值。
逆龄素改善心肌超微结构
在超微结构层面，逆龄素可有效改善心肌细胞间盘（ICD）、线粒体和肌节的老化相关损伤。ICD 负责维持心肌细胞间的机械耦联和电信号传递，其结构完整性对于心脏功能至关重要。透射电子显微镜（TEM）观察显示，3 个月龄 WT 小鼠的 ICD 结构完整（图 5H），而 24 个月龄对照组小鼠（图 5I、J）则表现出严重的超微结构异常，包括粘着斑（FA）破坏、间隙连接（GJ）断裂、桥粒（DS）部分撕裂，以及 ICD 两侧膜间距增宽。此外，老年小鼠心肌细胞内可见显著的线粒体肿胀、破裂及肌原纤维萎缩。然而，接受 3 个月逆龄素治疗后（图 5K），这些结构异常得到明显改善，ICD 结构恢复完整，线粒体形态及肌原纤维排列接近 3 个月龄小鼠的水平。
综合来看，这些结果表明，在自然老化的小鼠中，逆龄素可有效改善心脏的电生理功能，并延缓心脏老化进程。
逆龄素通过 Cisd2 依赖途径发挥抗衰老作用
本研究发现，逆龄素对衰老及相关表型的改善作用在很大程度上依赖于 Cisd2。为了验证这一假设，我们使用 Cisd2 mcKO 小鼠（MCK-Cre；Cisd2^f/f），该模型特异性敲除 Cisd2，影响其骨骼肌和心肌功能。结果显示，Cisd2 mcKO 小鼠在 3 个月大时即表现出明显的早衰特征，并且寿命缩短，其衰老表型与 26 个月龄的 WT 小鼠相当。
为了进一步评估 Cisd2 在逆龄素抗衰老作用中的重要性，我们从 3 个月龄开始，对 Cisd2 mcKO 和 WT 小鼠分别给予逆龄素或对照（Veh）治疗 4 个月，并在 7 个月龄时进行分析（附加文件 ：图 S8A）。检测结果表明，WT 组和 Cisd2 mcKO 组小鼠的血清及各组织（包括肝脏、骨骼肌和心肌）中的逆龄素浓度无显著差异（附加文件 ：图 S8B）。
在 WT 小鼠的骨骼肌功能检测中，转棒测试和组织病理学分析表明，无论接受逆龄素或对照（Veh）治疗，其肌肉功能和结构均保持正常，说明逆龄素对年轻的 WT 小鼠没有显著影响（附加文件 ：图 S8C、D）。然而，在 Cisd2 mcKO 小鼠 中，逆龄素未能改善其肌肉功能或逆转组织病理学损伤（附加文件 ：图 S8C、D）。Cisd2 mcKO 小鼠的骨骼肌表现出明显的退行性变化，包括肌纤维收缩、圆形纤维增多等病理特征（附加文件 ：图 S8D）。
同样，在 Cisd2 mcKO 小鼠的心脏 中，逆龄素未能改善其电生理异常（即心律失常）或减少心肌损伤和纤维化（附加文件 ：图 S9A–C）。这些结果表明，Cisd2 的存在对于逆龄素发挥其心脏和骨骼肌的抗衰老作用至关重要。
为了进一步区分逆龄素的 Cisd2 依赖性 和 非依赖性 作用，我们对以下四组小鼠的骨骼肌组织进行 RNA 测序分析：WT-NLS、WT-Veh、Cisd2 mcKO-NLS 和 Cisd2 mcKO-Veh（图 6A）。
差异表达基因（DEG）分析 显示，在 WT 小鼠中，91 个基因受到逆龄素调控（62 个上调基因，29 个下调基因），其中 79%（72/91）为 Cisd2 依赖性基因，21%（19/91）为 Cisd2 非依赖性基因（图 6B、C）。这表明，逆龄素的大部分基因调控作用依赖于 Cisd2，当 Cisd2 缺失时，这些基因的差异表达模式消失。
尽管如此，仍有 21% 的 DEG 在 Cisd2 mcKO 小鼠中仍然保持差异表达（图 6C），表明 逆龄素在一定程度上也具有 Cisd2 非依赖性作用。进一步的生物信息学分析（图 6D）揭示，Cisd2 依赖性 DEG 主要涉及线粒体功能（53/72，73.6%）和钙离子稳态（13/72，18.1%），这与 Cisd2 在维持线粒体健康及细胞内钙平衡中的关键作用相一致。
综上所述，本研究通过遗传学和转录组学证据表明，逆龄素的抗衰老作用主要通过激活 Cisd2 实现，其机制与线粒体功能调控和细胞稳态维持密切相关。
逆龄素治疗4个月后的 Cisd2 依赖和非依赖 DEG
为了进一步探索逆龄素在衰老过程中对基因表达的影响，我们对 3 个月大 WT 和 Cisd2 mcKO 小鼠 的 腓肠肌 进行了 RNA 测序分析。这些小鼠接受了膳食逆龄素（100 mg/kg/天）或对照（Veh）食物治疗 4 个月，在 7 个月大时牺牲。分析了以下四组小鼠：WT-逆龄素、WT-Veh、Cisd2 mcKO-逆龄素 和 Cisd2 mcKO-Veh。
B 图 显示，针对所有受逆龄素影响基因的主要成分分析（PCA），我们在 WT-Veh 和 WT-逆龄素组之间共识别出 91 个差异表达基因（DEG），其中 62 个为上调基因，29 个为下调基因（FDR < 0.2）。这些 DEG 进一步被分为 Cisd2 依赖性基因（72/91，79%） 和 Cisd2 非依赖性基因（19/91，21%）。
对 Cisd2 依赖性 DEG 和非依赖性 DEG 的协同分析结果显示，在 Cisd2 mcKO 小鼠 中，Cisd2 依赖性 DEG 在逆龄素治疗组和对照组之间无显著变化（mcKO-逆龄素 vs mcKO-Veh，p > 0.05），而 Cisd2 非依赖性 DEG 则在逆龄素治疗组和对照组之间表现出显著差异（mcKO-逆龄素 vs mcKO-Veh，p < 0.05），提示 逆龄素的效应主要依赖于 Cisd2 的存在。
D 和 E 图 展示了 Cisd2 依赖性和非依赖性 DEG 的通路分析结果。Cisd2 依赖性 DEG 主要涉及与 蛋白质合成、线粒体功能、细胞氧化应激 及 细胞死亡 相关的通路，而 Cisd2 非依赖性 DEG 主要涉及 代谢调节和细胞反应途径，这些结果进一步揭示了逆龄素通过调节多条重要的生物学通路来发挥抗衰老作用。
逆龄素治疗使转录组模式更接近年轻状态
为深入了解逆龄素对衰老的影响，我们还对 心肌和骨骼肌 进行了RNA测序，并进行了三组对比分析：（组1）26 个月 WT-Veh 与 3 个月 WT；（组2）26 个月 WT-Veh 与 26 个月 WT-逆龄素；（组3）26 个月 WT-逆龄素 与 3 个月 WT。我们设置 FDR < 0.1 作为显著性阈值。
从这三组 DEG 中，我们选择了 组1 中因自然衰老而表现出显著表达变化的基因。接着，使用 组2，进一步选择那些通过逆龄素治疗恢复的基因；最后，使用 组3，选择那些在 3 个月大 WT 小鼠和用逆龄素治疗的 26 个月大 WT 小鼠之间没有显著差异表达的基因。
GO 分类分析 表明，在 心脏 和 远端骨骼肌 中，逆龄素能够显著逆转衰老过程中发生的基因表达变化，且这些基因参与的生物过程和细胞成分相似（图 7A）。这些共同的功能改变主要涉及代谢、蛋白质合成、线粒体功能、氧化应激、细胞死亡、免疫反应等重要的衰老相关通路。
在心脏（图 7B、C）和骨骼肌（图 7D、E）中，逆龄素显著改善了衰老小鼠中排名前五的受影响通路。特别地，代谢调节、蛋白质合成、线粒体功能以及氧化应激相关通路均显示出逆龄素的积极调节作用。此外，逆龄素还显著降低了活性氧（ROS）和活性氮的水平，尤其是在 老年小鼠的肾脏和心肌中，其与 ROS 相关的 DEG 表达模式向年轻小鼠的表达模式转变（附加文件 ：图 S10、图 S11、图 S12）。
逆龄素对生物学过程和亚细胞定位的影响
为了进一步探讨逆龄素对衰老的修复效果，我们基于 GO 注释 对生物学过程和亚细胞定位进行了分析，使用 PANTHER 功能分类分析 GO。
B 图 显示，141 个 DEG（包括 126 个上调基因 和 15 个下调基因）在 逆龄素治疗 后得到了显著修复（26 个月 WT-Veh vs 3 个月 WT，FDR < 0.1）。这些基因的表达模式发生了显著改变，且老年心脏的转录组模式向年轻心脏的模式转变，进一步验证了逆龄素的抗衰老效果。
C 图 展示了逆龄素修复的 老年心脏中的 DEG，这些 DEG 被分组到与年龄相关的不同通路，并以百分比形式表示。通过热图分析，我们发现逆龄素显著影响了心脏衰老过程中多个关键的生物学途径，并使这些途径的表达水平恢复至年轻状态。
D 图 展示了逆龄素治疗后，腓肠肌（衰老骨骼肌）中所有 41 个 DEG（包括 9 个上调基因 和 32 个下调基因）的修复结果（26 个月 WT-Veh vs 3 个月 WT，FDR < 0.1）。这些 DEG 的修复同样表明，逆龄素能够使衰老的骨骼肌表达模式向年轻肌肉的模式转变，进一步支持了其抗衰老作用。
E 图 展示了在 衰老骨骼肌 中被逆龄素修复的 DEG，这些 DEG 被进一步分组到与年龄相关的不同通路中，并按比例表示。所有这些结果均表明，逆龄素在多个衰老组织中都能有效恢复与年龄相关的生物学途径，进一步展示其广泛的抗衰老效果。
在本研究中，所有小鼠均从 21 个月大 开始接受膳食逆龄素（100 mg/kg/天）或对照（Veh）食物治疗，直到 26 个月，并通过 MGI GO 术语查找器对数据进行分组和分析（p值 < 0.05）。这些数据为逆龄素的抗衰老作用提供了有力的支持，揭示了其通过调控关键的衰老相关路径在不同组织中的修复作用。
讨论
在本研究中，我们展示了 Cisd2 激活剂（逆龄素）能够作为一种有效的转化疗法，促进衰老逆转并延长健康寿命，尤其是在老年小鼠中。我们的研究揭示了三个关键发现：
首先，Cisd2 可以被小化合物激活，逆龄素作为其中一种激活剂，能够有效提高 Cisd2 表达水平。我们发现，逆龄素在老年小鼠中的晚期治疗能够将 Cisd2 提升至接近年轻小鼠的水平。此增强的 Cisd2 表达似乎能延缓衰老过程，恢复衰老组织的活力，从而有助于延长健康寿命并促进长寿。
其次，逆龄素对衰老相关的多种结构性缺陷和功能完整性产生了显著的有益作用。具体来说，逆龄素在老年小鼠中恢复了与年龄相关的全身能量耗竭、体内脂肪减少、肌肉损伤修复以及消瘦恢复等问题。此外，逆龄素还延缓了心脏和骨骼肌的衰老进程，进一步表明其对全身健康恢复具有关键作用。
最重要的是，逆龄素的抗衰老作用是 Cisd2 依赖性 的。当 Cisd2 不存在时，逆龄素的作用显著减弱，表明 Cisd2 在逆龄素作用中的关键作用。逆龄素的作用不仅仅是延缓衰老，还能促使老年组织的转录组模式向年轻小鼠的模式转变，尤其在 基因表达、粒线体功能、氧化压力、细胞死亡、免疫反应 和 衰老相关炎症 等生物学过程中均展现了类似年轻小鼠的特征。
逆龄素与健康寿命延长
针对人类健康寿命延长的相关研究表明，尽管抗氧化剂、叶酸、B 族维生素以及多种维生素补充剂广泛应用，但其在延长健康寿命方面的效果并不显著。相反，一些动物模型的研究表明，抗氧化剂补充剂治疗不仅未能显著延长寿命，甚至可能有不良影响。然而，逆龄素作为一种天然黄烷酮苷元，表现出显著的抗氧化效果，能够通过清除活性氧（ROS）和减少过氧化作用而无细胞毒性。此外，逆龄素作为 过氧亚硝酸盐（ONOO-） 清除剂，能够有效抑制氧化反应并减少细胞损伤，具有明显的抗衰老和抗癌作用。
之前的研究也表明，逆龄素在动物模型中能够抑制多种化学诱导的癌症，如膀胱癌、乳腺癌等，并通过抑制心肌缺血和减弱心肌梗塞后的心肌纤维化，展现出对心脏的保护作用。在肝脏中，逆龄素还显示出对糖代谢的调节作用，能够改善代谢紊乱。
逆龄素作为CR类似物的替代方案
热量限制（CR）被认为是唯一已知的非遗传、非药物干预方法，能够延长寿命并延缓多种与年龄相关的疾病。CR 通过调节多条分子信号通路，如 胰岛素/胰岛素生长因子、sirtuins、AMP 激活蛋白 以及 mTOR 路径，发挥其抗衰老效应。虽然几种 CR 类似物（如白藜芦醇、二甲双胍和雷帕霉素）在研究中显示出一定的潜力，但它们仍存在副作用，如长期使用雷帕霉素可能导致糖代谢紊乱，二甲双胍也可能引发胃肠道不适。
相比之下，逆龄素作为一种 Cisd2 激活剂，能够在不产生明显副作用的情况下延缓衰老进程并改善与年龄相关的功能。我们的研究表明，逆龄素作为膳食补充剂，能够在雄性小鼠的晚年阶段安全使用，并有效改善其衰老相关的生理特征。因此，逆龄素可能成为热量限制（CR）类似物的一个有效替代品，为老年医学提供了一种新的干预策略。
总的来说，本研究成功验证了逆龄素通过活化 Cisd2 延缓衰老并延长健康寿命的潜力，为抗衰老药物开发和健康衰老策略的研究提供了新的方向。
实验结论
本研究首次验证了 逆龄素 作为 Cisd2 激活剂 在抗衰老中的潜力，证明了其能有效延缓衰老过程。我们的研究结果为使用 Cisd2 作为分子靶点，筛选和开发能够激活 Cisd2 的新型化合物提供了实验依据。这为未来将这些化合物转化为可应用于老年医学的临床治疗方案奠定了基础。
最重要的是，逆龄素在多个重要器官和组织中展现出了显著的生物活性，尤其是在 骨骼肌、心脏 和 肝脏 等衰老相关组织中的效果。通过为期四个月的治疗，逆龄素没有在体内显示出任何明显的毒性反应，尤其是在剂量为 100 mg/kg/天 时，这相当于人类每天 491 mg/60 kg 的相应剂量，且无显著副作用。
因此，将逆龄素开发为药用或营养功能性食品具有巨大的潜力，特别是在预防衰老相关疾病和促进健康老龄化方面。其应用不仅可以延长健康寿命，还可能为治疗与年龄相关的多种疾病提供新的策略。这一发现为未来开发基于 Cisd2 活化 的抗衰老药物或补充剂开辟了新的前景。
缩写
Agl：Glycogen debranching enzyme（糖原去支链酶）
BAC：Bacterial Artificial Chromosome（细菌人工染色体）
CBC：Complete Blood Count（全血细胞计数）
CR：Calorie restriction（热量限制）
DEG：Differentially Expressed Genes（差异表达基因）
ECG：Electrocardiography（心电图检查）
EE：Energy expenditure（能量消耗）
FDR：False Discovery Rate（假发现率）
G1P：Glucose 1-phosphate（葡萄糖-1-磷酸）
G6P：Glucose 6-phosphate（葡萄糖-6-磷酸）
G6pc：Glucose-6-phosphatase alpha（葡萄糖-6-磷酸酶 α 亚型）
GO：Gene Ontology（基因本体论）
GTT：Glucose tolerance test（葡萄糖耐量测试）
N7G：Nilingsu-7-O-beta-D-glucuronide（逆龄素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸酯）
N7S：Nilingsu-7-O-sulfate（逆龄素–7-O-硫酸酯）
NLS： Nilingsu (逆龄素)
HPLC：High Performance Liquid Chromatography（高效液相色谱）
ICD：Intercalated disc（间隙盘）
ITT：Insulin tolerance test（胰岛素耐受性测试）
mcKO：Skeletal and cardiac muscles tissue-specific knockout（骨骼肌和心脏肌肉组织特异性基因敲除）
MGI：Mouse Genome Informatics（小鼠基因组信息学）
Pgm2：Phosphoglucomutase 2（磷酸葡萄糖变位酶 2）
PhK：Phosphorylase kinase（磷酸化酶激酶）
PKAα：Protein kinase A alpha（蛋白激酶A α 亚单位）
Pygl：Glycogen phosphorylase（糖原磷酸化酶）
ROS：Reactive oxygen species（活性氧种）
RPKM：Reads per kilobase of exon model per million reads（每百万次读取的外显子模型每千碱基读取数）
TEM： Transmission electron microscopy（透射电子显微镜）
TG：Transgenic（转基因）
VCO2 : Carbon dioxide production rate（二氧化碳产生速率）
Veh：Vehicle（载体）
VO2 : Oxygen consumption rate （氧气消耗速率）
WT：Wild-type（野生型）
附加文件
图 S1:
图 S2:
图 S3:
图 S4:
图 S5:
图 S6:
图 S7:
图 S8:
图 S9:
图 S10:
图 S11:
图 S12:
