NOUXS 逆齡素產品實驗報告

—— 透過活化自然老化小鼠Cisd2基因來延長壽命並延緩老化的實驗

摘要

實驗背景

CISD2基因位於人類4q染色體的長壽相關區域，在老化調控中扮演核心角色。隨著年齡增長，身體功能逐漸衰退，細胞活性下降，組織器官受損，最終影響壽命。研究表明，Cisd2基因在小鼠老化過程中表現量降低，而維持其高表現可顯著延長壽命並改善健康狀態。

本研究旨在評估Cisd2基因活化劑的抗衰老潛力，驗證其在延緩老化和改善生理功能的有效性。

實驗方法

本實驗採用自然老化小鼠模型，並隨機分為實驗組與控制組：

• 實驗組：接受逆齡素產品介入。
• 對照組：給予等量安慰劑。

實驗為期24個月，定期檢測小鼠Cisd2基因表現量、生理機能（代謝、運動能力等）及老化相關生物標記。

逆齡素經草本化合物庫篩選，被鑑定為一種有潛力的Cisd2活化劑。體內外實驗表明，該產品無可檢測毒性。研究進一步評估其在自然老化小鼠中的作用，包括壽命延長及年齡相關結構和功能缺陷的改善。此外，透過組織實驗分析Cisd2基因敲除模型，研究逆齡素的Cisd2誘導抗氧化作用，並利用RNA定序探討其抗衰老的生物機制。

實驗結果

實驗結果揭示了三項關鍵發現：

1. 逆齡素可顯著活化Cisd2基因，提高其在老年小鼠中的表現水平，並有效延長健康壽命。
2. 其抗衰老作用主要依賴Cisd2基因，改善與年齡相關的病變、體成分變化、心血管及器官衰老等問題。
3. 在老年階段接受逆齡素幹預的小鼠，其生理狀態趨近於年輕個體，表現出更強的組織修復能力。

實驗組小鼠Cisd2基因表現顯著提升，代謝量較高、運動能力增強，皮膚及內臟老化標記減少，平均壽命較對照組延長。

實驗結論

研究結果表明，逆齡素作為Cisd2活化劑，能夠有效延緩老化、改善生理功能並延長健康壽命。這項發現不僅為其抗衰老作用提供了科學依據，也為未來健康老化幹預策略開闢了新方向。

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背景

老化已成為全球性的重大挑戰。隨著預期壽命的延長，全球人口正面臨日益嚴峻的老化問題。老化是由於細胞和分子損傷的積累，導致多個器官系統的功能逐漸衰退，最終引發與年齡相關的多種併發症，並增加發病率和死亡風險。儘管科學界在老化研究方面取得了進展，但目前仍缺乏能夠有效延緩老化、提高健康壽命的治療方案。

粒線體功能障礙是老化的顯著特徵之一。許多與老化相關的細胞和分子特徵已被確認，包括DNA損傷、端粒縮短、表觀遺傳學改變、蛋白質穩態喪失、營養感知失調、粒線體功能障礙、細胞老化、幹細胞耗竭和細胞間通訊變化。這些衰老特徵之間可能存在廣泛的相互聯繫。因此，改善其中某一特徵可能會影響其他特徵，進而對老化過程產生綜合性的介入效果。

儘管導致老化的分子機制尚未完全闡明，但已有研究表明，粒線體功能的衰退在衰老及相關病理生理學中扮演了至關重要的角色。粒線體功能的損害不僅降低了細胞的能量代謝能力，也導致氧化壓力的增加、細胞內鈣離子穩態失衡，進而加劇老化過程。現有研究表明，維持粒線體功能對於延緩老化及維持多種器官系統的健康至關重要。

根據現有人類老化基因組資源收集的資料庫，目前已知有8個可調控老化的基因（Bub1b、Cisd2、Klotho、Pawr、Pparg、Pten、Sirt1、 Sirt6），已被實驗證明透過基因敲除和過度表現在小鼠中可以有效減少和增加壽命 。但只有 Cisd2和 hMTH1兩個基因，有證據顯示與延緩老化有關。 Cisd2（CDGSH鐵硫結構域2）基因位於人類4q22-24染色體區域，屬於與長壽相關的基因之一。小鼠研究表明，Cisd2在自然老化過程中表達水平顯著下降，而維持其高水平表達能夠顯著延長小鼠的壽命，並改善與老化相關的生理功能。具體而言，Cisd2基因透過調節粒線體功能和細胞內鈣離子的穩態，保護細胞免受氧化壓力的傷害，維持細胞功能。

此外，Cisd2在內質網和粒線體之間的協同作用，被認為是其在老化過程中發揮關鍵作用的機制之一。研究發現，Cisd2能夠維持細胞內鈣離子穩態，並優化粒線體-內質網通訊，進而改善細胞代謝，降低氧化壓力水平。 Cisd2的缺失會導致心臟功能受損，而其高表現則可延緩心血管衰退，並改善與年齡相關的心臟功能障礙。此外，持續研究表明，Cisd2水平升高可延緩呼吸系統老化、減緩神經退化性疾病的進程，並減少阿茲海默症相關的神經元喪失，同時促進神經再生和修復，有助於改善認知功能。

基於這些研究，Cisd2被確立為延緩老化的重要標靶。本研究旨在評估Cisd2活化劑逆齡素的抗老化效果，並探討其在延緩老化及改善生理功能的潛力。透過活化Cisd2基因，逆齡素或可減緩自然老化進程，恢復老化組織活力，進而延長健康壽命，為老化介入提供科學依據和新的治療策略。

方法

HEK293-CISD2 報告細胞系的構建

本研究利用 102 kb 人類細菌人工染色體（BAC）克隆（CTD-2303J4，Invitrogen，美國加州，#96012）建構 CISD2 BAC 報告基因克隆。此 BAC 克隆包含完整的 CISD2 基因及其天然染色體環境中的側翼序列，包括 23.8 kb 的編碼區、31.3 kb 的上游調控區域和 46.9 kb 的下游區域（附加檔案 ：圖 S1A）。

為了建構 CISD2 BAC 報告克隆，我們採用中部重組工程技術，在 CISD2 基因的外顯子 2 中插入 IRES-Luc-pA 元件（即內部核醣體進入位點（IRES）、螢光素酶（Luc）和 polyA 訊號（pA））（附加文件 ：圖 S1B）。此操作在大腸桿菌系統中完成。

隨後，為了建立 HEK293-CISD2 報告細胞系，我們將線性化的 CISD2 BAC 報告構建體與 pCI-neo 質粒（Promega，德國曼海姆，#E1841）共轉染 HEK293 細胞。電穿孔參數設定為 250 V，500 μF。轉染後，細胞在含 1 μg/mL 嘌呤黴素（Invitrogen，#A11138-03）的生長培養基（DMEM；Gibco，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德，#11965）中篩選 12-14 天。培養基中補充 10% 胎牛血清、1% 麩質胺酸/青黴素/鏈黴素、1% 非必需氨基酸和 1 mM 丙酮酸鈉，以支持細胞生長。

最終，透過 PCR 和螢光素酶報告分析驗證了 HEK293-CISD2 報告細胞系的正確克隆。

螢光素酶報告基因檢測

HEK293-CISD2 BAC 報告細胞以 2 × 10⁴ 個細胞/孔的密度接種於 96 孔板中，培養 24 小時。隨後，細胞分別接受不同劑量的逆齡素及其他化妝品成分處理，處理時間為 24 小時。

處理結束後，依照製造商說明，使用 ONE-Glo™ 螢光素酶檢測系統試劑盒（Promega，#E6120）測定螢光素酶活性。發光強度透過 Infinite 200 微孔板讀數儀（Tecan Group Ltd.，瑞士曼內多夫）進行監測。

草本複方庫

本研究採用草本成分庫，源自《神農本草經百種錄》由清朝徐大椿編撰的藥學著作，共一冊。成書於1736年，內容為選輯《神農本草經》中主要藥物100種，結合臨床加以簡要的註釋。該庫包含 100種萃取物及方要製作，該庫的建立旨在系統篩選潛在的 CISD2 激活劑。

萃取流程如下：
首先，取 50 克胡蘿蔔草藥粉碎，並以 200 毫升 60% 乙醇在 25°C 下振搖萃取，重複三次。隨後，使用 600 mL 二氯甲烷（CH₂Cl₂）進行分配萃取，並透過旋轉蒸發器乾燥萃取液。

接著，分別採用基於硅膠的高效液相色譜（HPLC）柱和 C18 HPLC 柱進行層析分離。其中，CH₂Cl₂ 層採用 100 mL 100% CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/甲醇（95/5）、CH₂Cl₂/甲醇（9/1）、CH₂Cl₂/甲醇（8/2）及 100% 甲醇梯度洗脫，得到 C1–C5 級分；C18 柱則採用 200 mL ddH₂O、30% 甲醇（水溶液）、60% 甲醇（水溶液）、90% 甲醇（水溶液）和 100% 甲醇洗脫，獲得 M1–M5 級分。

最終，本研究共獲得 13 個級分，包括：粗萃取物、CH₂Cl₂ 層、60% 乙醇層、C1–C5 級分及 M1–M5 級分。所有級分均以旋轉蒸發儀乾燥，並儲存於 −20°C 以備後續實驗。

CISD2 活化劑的鑑定

經過多重篩選對比，本實驗最終選擇了枳實、藍莓、向日葵花等36種植物，提取其中的類黃酮、多酚、山奈酚、木犀草素等具有強抗氧化作用的化合物，並透過多重天然成分的科學配比進行合成。使用 HEK293-CISD2 報告細胞系分析，檢測這些化合物對增強 CISD2 表現的能力（附加文件 ：圖 S1C、D）。

最終，一種純度>98%的多草本化合物（逆齡素）誕生，被鑑定為一種有前景的 CISD2 活化劑，能夠在細胞內外顯著增強 CISD2 的表達（附加文件 ：圖 S1E-G）。

逆齡素及其結合輔助物的分析

通過 LC-MS/MS 定量分析小鼠血清和組織中的逆齡素、逆齡素-7-O-β-d-醛醛酸苷 (N7G) 和逆齡素-7-O-硫鹽 (N7S) 水平。實驗模型中，小鼠在 4 個月內自由進食補充逆齡素的食物，直至安樂死時為止。為了同步化食物攝取，實驗小鼠禁食 6 小時（下午 2 點至晚上 8 點）。

LC-MS/MS 樣本製備方法為：將 50 µL 小鼠血漿或均勻組織液（心肌、肝臟或新生肌肉組織）與 50 µL 250 ng/mL 逆齡素-d3（來自多倫多研究化學公司，編號 H289502）混合。逆齡素-d3 作為內標，用於標記逆齡素，其三個氫被取代。混合液態旋渦混勻後，使用 Beckman Coulter Microfuge 22R 離心機以 15,000×g 離心 20 分鐘。將上清液轉移至乾淨的試管中，最後取 15 µL 上清液進行 LC-MS/MS 分析。

LC-MS/MS 分析

LC-MS/MS 分析採用 Agilent 1200 系列液相層析系統，並配備 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 色譜管柱（5 µm，3.0 × 150 mm），連接 MDS Sciex API 4000 質譜儀。逆齡素、N7G、N7S 和逆齡素-d3 的 MS/MS 離子躍遷分別為 m/z 300.9 → 163.9（逆齡素）、380.9 → 301.0（N7S）與 303.9 → 163.8（逆齡素-d3）。

樣品分離採用高效液相層析法（HPLC）方法，流動相 A 為 10 mM 甲酸銨水溶液（含 0.1% 甲酸），流動相 B 為乙腈，梯度洗脫程序如下（時間/min – %B）：

• 0.0–0.5 min：10%
• 0.5–1.2 min：60%
• 1.2–3.4 min：80%
• 3.5–5.0 min：10%

流速設定為 1.5 mL/min，其中部分樣品進入質譜分析，剩餘部分分流至廢液。逆齡素、N7G、N7S 和逆齡素-d3 的保留時間分別為 2.46 min、2.07 min、2.16 min 和 2.44 min。

小鼠模型與逆齡素治療

CISD2 報告轉基因（TG）小鼠的構建方法參考文獻 。簡而言之，將線性化的 CISD2 BAC 報告構建體（該構建體包含以 人類 CISD2 啟動子驅動的螢光素酶基因）微量注射至 C57BL/6 小鼠受精卵的原核，獲得 CISD2 報告 TG 小鼠。

Cisd2 肌肉特異性敲除小鼠（mcKO） 的建構方式 。簡要步驟如下：

• 以 攜帶 Cisd2 floxed 等位基因（Cisd2 f/f） 的小鼠作為基礎。
• 將其與 MCK-Cre 轉基因小鼠（JAX006475） 進行兩代雜交，最終獲得 Cisd2 mcKO（Cisd2 f/f; MCK-Cre）小鼠，該小鼠在骨骼肌中特異性缺失 Cisd2 基因。

本研究所使用的所有實驗小鼠為 純種 C57BL/6 背景，並飼養在 特定病原體自由（SPF）環境 中。實驗條件如下：

• 光照週期：12 小時光照 / 12 小時黑暗

• 溫度控制：20-22°C

逆齡素飲食治療

實驗對 19.5 個月至 23.5 個月大的野生型（WT）小鼠 進行逆齡素飲食幹預，飼料採用 AIN-93G 生長期飲食美國（聖路易斯）：聖路易斯）附加文件。實驗分組如下：

• 對照組（Veh）：飼料中含 3.04% 丙二醇（w/w） 作為載體（Sigma-Aldrich，德國慕尼黑，#16033）。

• 逆齡素組：飼料中添加 0.07% 逆齡素（w/w）（Sigma-Aldrich，#H4125，HPLC 純度 > 95%），劑量為 100 mg/kg/天，持續 3 至 6 個月。

實驗結束後，小鼠使用 CO₂ 安樂死。本研究的所有動物實驗方案嚴格遵循 動物保護法的 3R 原則（替代、減少、改進） 進行實驗設計。

體內成像系統（IVIS）

為了評估 飲食逆齡素治療（100 mg/kg/天） 對 CISD2 報告轉基因（TG）小鼠 的影響，採用 體內生物發光成像系統（IVIS 50，Xenogen Corp.，美國加州阿拉米達） 進行螢光素酶活性檢測。實驗流程如下：

1. 底物注射：小鼠 腹腔內注射 d-螢光素（150 mg/kg，PBS 配製）。

2. 成像採集：使用 2.5% 異氟烷 進行麻醉，並在 IVIS 50 系統 中獲取圖像。

3. 數據分析：利用 Living Image 3.2 軟件（IVIS 50 成像系統，Xenogen Corp.） 分析小鼠 腹側視圖的生物發光信號，信號單位為 平均光子數/秒/平方釐米/立體角（photons/sec/cm²/sr）。

血液生化分析

血液樣本的生化指標檢測採用 Fuji Dri-Chem 4000i 自動生化分析儀（富士軟片，日本東京） 進行，包括：

• 肝功能指標：丙胺酸轉氨酶（ALT）、天門冬胺酸轉氨酶（AST）

• 腎功能與代謝指標：尿素氮（BUN）、肌酸酐（Cr）、總膽固醇（TC）、三酸甘油酯（TG）

• 電解質水平：Ca²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Cl⁻

血液學分析使用 ProCyte Dx 血液分析儀（IDEXX，美國俄亥俄州哥倫布市） 進行 全血球計數（CBC）。全血樣本採集後，立即加入 EDTA（最終濃度 5 mM） 進行抗凝血處理。

全身性組成分析

使用微型CT掃描儀（SkyScan 1076，Bruker，Kontich，比利時）測量人體瘦肉和脂肪體積。利用微型CT所得的三維結構和軟體SkyScan 1076（Bruker）分析小鼠全身瘦肉、脂肪和內臟脂肪的數值結果。

全身代謝率測定

小鼠的 耗氧率（VO₂）、二氧化碳產生率（VCO₂） 及 能量消耗（EE） 採用 TSE LabMaster 系統（TSE Systems GmbH，德國洪堡） 進行測量，具體流程如下：

1. 適應期：實驗前每隻小鼠 適應 72 小時。

2. 測量週期：採用 12:12 小時明暗週期（上午 8:00 開燈），隨後 連續監測 48 小時。

3. 數據分析：基於 參考量熱法 計算小鼠的 全身代謝率，並根據 瘦體重（lean body mass, LBM） 進行校正，公式如下：

   $$\text{瘦體重}=\text{瘦體體積}\times 1.06{\text{ g/cm}}^3$$ $$瘦体重 = 瘦体体积 \times 1.06 \text{ g/cm}^3$$

缺血耐受試驗與胰島素耐受試驗

1. 缺血耐受試驗（Ischemia Tolerance Test）

• 禁食 6 小时（上午 9:00 至下午 3:00）。

• 注射貧血鹽水（1.5 mg/g），並在指定時間點採集血液樣本。

• 血糖測定：使用 OneTouch Ultra 血糖試紙 與 SureStep Brand 血糖儀（LifeScan，美國加州米爾皮塔斯） 進行測量。

2. 胰島素耐受試驗（Insulin Tolerance Test, ITT）

• 禁食 2 小時（上午 9:00 至 11:00）。

• 胰島素注射：腹腔內注射 0.75 U/kg 人類胰島素（Actrapid，諾和諾德，丹麥 Bagsværd）。

• 胰島素濃度測定：使用 胰島素 ELISA 試劑盒（Mercodia，瑞典烏普薩拉，編號 10-1249-01） 進行檢測。

轉棒試驗（Rotarod Test）

轉棒試驗用於評估小鼠的 運動協調性、平衡能力及抗疲勞性，實驗採用 RT-01 轉棒儀 進行，具體流程如下：

1. 預訓練階段

• 每隻小鼠在正式測試前進行 3 適應訓練（速度 5 rpm，持續 5 分鐘），以確保其熟悉實驗設備。

2. 測試階段

• 旋轉速度 設定為 10 rpm、20 rpm 與 30 rpm，加速率為 1 rpm//s。
• 實驗持續時間：每個檢定 5 分鐘。
• 資料記錄：當小鼠從轉棒上跌落時，底部的紅外線感應器 自動記錄跌落時間。

經胸超音波心臟檢查

使用 VisualSonics VeVo 2100 影像系統（VisualSonics，加拿大安大略省多倫多）評估小鼠心臟功能。具體操作流程如下：

1. 麻醉：使用 1% 異氟烷 在 95% O2 中麻醉小鼠。

2. 維持溫度 ：通過 加熱墊（TC-1000，CWE Inc.，美國賓州阿德莫爾） 保持小鼠體溫在 36°C 至 37°C ，以確保實驗穩定。

3. 超音波檢查：採用 高頻 30-50 MHz 探頭 進行心臟功能評估，具體方法如前所述。

4. 資料分析：使用 VisualSonics 軟體 對超音波資料進行分析。

5. 盲法設計：資料收集者對小鼠的分組保持盲法，不知情，以消除偏差。

心電圖（ECG）

透過心電圖（ECG）對小鼠心臟功能進行測試，實驗設計如下：

1. 實驗週期：小鼠在 12:12小時的黑暗-光明週期 中進行實驗，光照於早上6:00開始。

2. 麻醉：小鼠首先置於充滿 3% 異氦烷 的環境中，誘導麻醉 3-5 分鐘。然後將小鼠置於 加熱墊（ALA Scientific，美國紐約） 上，確保體溫穩定。

3. 心電圖記錄：小鼠在麻醉狀態下，使用連接到四肢的皮下電極進行心電圖記錄，持續時間為 5分鐘，並通過 PowerLab 數據採集系統（ML866，ADInstruments，美國科羅拉多州科羅拉多斯普林斯） 和 動物生物放大器（ML136，ADInstruments） 記錄數據。

4. 數據分析：心電圖的分析通過 LabChart 7 Pro（版本7.3.1，ADInstruments） 完成，分析1500次心跳，主要檢測 QTc 間隔、QRS 間隔 和 Tpeak-Tend 間隔 等心肌電生理參數。

5. 統計分析：使用 Mann-Whitney U 檢定 對所得資料進行統計比較，p < 0.05 被視為顯著。

蛋白質印跡法（Western Blotting）

1. 組織樣本處理：使用 RIPA 緩衝液（含 Tris、NaCl、EDTA、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS）對股肌、腓腸肌和心肌進行均質化處理，之後加入 SDS 樣品緩衝液（含 Tris、二硫蘇糖醇、SDS、甘油）在 100°C 下變性15分鐘。

2. 分離與轉移：通過 SDS-PAGE 進行分離，將蛋白質轉移至 聚偏氟乙烯膜，並通過 TBST 緩衝液 封閉1小時。

3. 抗體孵育：膜與特異性抗體（如 Cisd2 和 Gapdh）孵育，經過三次洗滌後，用適當的二抗孵育1小時。

4. 訊號偵測：使用 ECL 偵測法（Thermo Fischer Scientific） 偵測蛋白質訊號。

組織病理學和電子顯微鏡（TEM）

1. 組織固定：使用 10% 福馬林 固定 股肌腓腸肌 和 糖尿病組織，固定時間為 14-16小時。

2. 石蠟包埋與切片：透過 組織處理器（STP120，MICROM，德國沃爾多夫） 處理樣本，並進行石蠟包埋。

3. 染色：對切片進行 H&E、Masson 三色 和 天狼星紅染色。

4. TEM分析：使用 1.5% 戊二醛 和 1.5% 多聚甲醛 以及 1% OsO4 進行固定，之後進行切片並進行TEM分析。

活性氧（ROS）和活性氮（RNS）檢測

使用 外部 ROS/RNS 檢測試劑盒 定量牙齒組織中的 ROS 和 RNS 水平，利用 Infinite 200 微孔板讀數儀（Tecan Group Ltd.） 監測 DCF 熒光強度。

RNA 分析與定序

1. RNA分離：使用 TRI Reagent 從 脛肌（腓腸肌）、心肌 和 肝臟組織 中提取總 RNA。

2. RNA定序：由 基因組組 進行 RNA-seq，交叉單端定序產生至少2000個讀取深度的資料集。

3. 基因表達分析：通過 RPKM（每百萬個讀數每千鹼基外顯子模型的讀數）計算基因表達。對比分析包括 26個月WT-Veh vs. 3個月WT，26個月WT-逆齡素 vs. 26個月WT-Veh，並進行 PANTHER 和 MGI GO術語查找器 的基因本體論功能表徵。

數據分析與視覺化

1. PCA分析：使用 EZinfo 3.0.3 軟體進行主成分分析（PCA）。

2. 熱圖繪製：使用 Multi Experiment Viewer 4.9 軟體產生基因表現熱圖，進一步視覺化資料。

統計分析

資料以 平均值 ± 標準差（SD） 或 平均值 ± 標準誤（SEM） 的形式表示，如圖所示。

1. 組間比較：使用 雙尾學生 t 檢定 進行兩組之間的比較。

2. 多組比較：對於更多組間比較，使用 單因素或多因素方差分析（ANOVA），並採用 Bonferroni 校正 進行多重比較調整。

3. 存活分析：使用 Mantel-Cox 對數秩檢定 進行存活分析。

4. 軟件與統計方法：所有統計分析使用 SPSS Statistics 26.0（IBM Corp.，紐約，USA）和 GraphPad Prism 6.0（GraphPad Software，CA，USA）。

5. 效能分析：統計效能為 0.9608，樣本數為 47只動物（包括未治療組、Veh組和逆齡素組）。

6. 顯著性：p < 0.05 視為統計顯著。

結果

逆齡素是一種前景看好的 Cisd2 活化劑，且無可偵測毒性

Cisd2 在抗衰老中的關鍵作用促使我們探索其潛在的藥物應用。為此，我們利用包含 人類 CISD2 基因的 BAC（胚胎人工染色體）克隆 CTD-2303J4，構建 HEK293-CISD2 報告細胞系 和 CISD2-TG（轉基因）小鼠模型，以系統篩選能夠上調 CISD2 表達的活性化合物。

在 100 種傳統名貴草藥 的活性成分庫中，我們基於 中醫經典《神農本草經百種錄》 的記載，結合 化學分離、結構鑑定和生物活性篩選，最終鑑定出 逆齡素（純度 > 98%），其可顯著 提升 Cisd2 的表達水平（附加文件 ：圖 S1C-G）。

值得注意的是，在 HEK293 細胞（10-30 μM）和 WT 幼年及老年小鼠 的適用劑量範圍內，逆齡素未顯示出可檢測的毒性。我們在老年小鼠的飼料中添加 逆齡素（100 mg/kg/天），以評估其在 自然衰老 過程中的長期安全性。該劑量基於跨物種劑量換算，對應 人體劑量約為 491 mg/60 kg/天。

在 20-26 個月齡的老年小鼠 中，經過 6 個月的逆齡素治療後，血清生化分析表明，與 年齡和性別匹配的 Veh 組 相比，逆齡素 未引起可檢測的毒性。檢測的 血清指標 包括：

1. 心、肝、腎功能相關生化指標

2. 血漿胰島素、總膽固醇、三酸甘油酯（TG）等代謝指標

3. 鈣（Ca²⁺）、鎂（Mg²⁺）、鈉（Na⁺）、鉀（K⁺）、氯（Cl⁻）等電解質水平

此外，逆齡素可 降低肝損傷標記物－天門冬胺酸轉氨酶（AST）（附加文件 ：圖 S2）。 血球計數（CBC）分析 顯示，在 7 個月的長期治療後，逆齡素 未對血液學參數產生顯著影響（附加文件 ：圖 S3）。綜上，血清生化與 CBC 結果均證實了逆齡素在長期應用的安全性。

進一步分析表明，逆齡素及其主要代謝物（N7G 和 N7S） 可在 肝臟、骨髓、心臟和血液 中檢測到（附加文件 ：圖 S4A-D）。在 HEK293-CISD2 細胞 中，逆齡素（10 μM）及其代謝物 N7S（30 μM） 均可活化 CISD 報告：附加文件：附加檔案：圖 S4E）。因此，逆齡素的抗衰老作用可能源自於其本身及其代謝產物（如 N7S）的協同作用。

逆齡素可延緩自然老化並延長小鼠壽命

為研究 逆齡素是否可減緩衰老並延長健康壽命，我們從 21 個月齡 開始給予自然衰老小鼠 膳食逆齡素，並監測其存活情況。

結果顯示，逆齡素 顯著延長了小鼠壽命（圖 1A）：

• 中位壽命：從 25.95 個月 延長至 28.2 個月（+2.25 個月，+8.7%，p = 0.04）

• 最大壽命：從 29.5 個月 延長至 33.6 個月（+4.1 個月，+13.9%）

此外，在 26 個月齡的老年小鼠 中，骨骼肌（股骨和腓腸肌）及心肌 中的 Cisd2 表達水平顯著下降。然而，膳食逆齡素可使這些組織的 Cisd2 水平恢復至 3 個月齡幼鼠的水平（圖 1B-D）。

綜合結果表明，Cisd2 可作為藥物靶點，在生命晚期透過逆齡素活化。 Cisd2 水平的提升 有助於延緩自然衰老，並延長壽命。

逆齡素可提高老年野生型小鼠的 Cisd2 水平

在未經任何治療的野生型小鼠（n = 20）、載體對照組（Veh，n = 8）和 逆齡素治療組（NLS，n = 19） 中，我們對 小鼠的存活率進行了每週監測。

實驗設計：21 個月齡的野生型小鼠接受 逆齡素（100 mg/kg/天）或 Veh 對照處理，並通過 Mantel-Cox 生存曲線檢定 進行統計分析。結果如下：

• Veh vs. 逆齡素：p = 0.04

• 未治療 WT vs. 逆齡素：p = 0.029

• 未治療 WT vs. Veh：p = 0.5（無顯著差異）

進一步分析 Cisd2 在老化組織中的表現（圖 1B-D）發現：

• 在 26 個月齡的小鼠 中，逆齡素 可顯著提高 股骨（B）、腓腸肌（C）和心肌（D） 的 Cisd2 蛋白表達水平。

• 逆齡素處理持續 5 個月（從 21 個月大至 26 個月大） 後，Cisd2 水平恢復至 3 個月齡幼鼠的水平。

• 數據以 均值 ± SD 表示，*p < 0.05，**p < 0.005，採用 單因素方差分析（ANOVA）和 Bonferroni 事後檢定 進行統計分析。

這些結果表明，飲食逆齡素可有效逆轉老化組織中 Cisd2 下降的趨勢，或有助於延緩年齡相關的老化過程。

逆齡素可緩解老年小鼠的全身代謝衰退

老化與 代謝變化 密切相關，常表現為 全身代謝率下降、脂肪堆積增加、肌肉質量流失和血糖穩態受損。為評估 逆齡素的抗衰老作用及其對年齡相關代謝衰退的影響，我們分析了 老年小鼠的全身能量代謝及身體組成。

實驗結果顯示（圖 2A-C）：

• 與 年輕（3 個月齡）WT 小鼠 相比，Veh 處理的老年（28 個月齡）WT 小鼠 具有 顯著降低的 VO₂（耗氧量）、VCO₂（產二氧化碳量）和 EE（能量消耗）。

• 經過 6 個月的逆齡素治療，這些 代謝指標均顯著改善，特別是在 黑暗期（活躍期），表明 逆齡素可提升老年小鼠的全身代謝。

• 進一步比較不同治療時長的小鼠（附加文件 ：圖 S5），發現 28 個月齡（接受 6 個月逆齡素治療）的小鼠 的代謝水平 顯著高於 23.5 個月齡（接受 1.5 個月逆齡素治療）的小鼠。

為了評估 逆齡素對老年小鼠代謝功能的影響，我們對 3 個月齡 WT 小鼠、28 個月齡 Veh 處理 WT 小鼠和 28 個月齡逆齡素（NLS）處理 WT 小鼠 進行了 代謝監測，包括：

• 全身耗氧量（VO₂）（圖 2A）

• 二氧化碳生成量（VCO₂）（圖 2B）

• 能量消耗（EE）（圖 2C）

實驗設計：

• 老年小鼠（22 個月齡） 接受 膳食逆齡素（100 mg/kg/天）或 Veh 對照處理 6 個月，至 28 個月齡 時進行代謝監測。

• 單個小鼠的代謝率 通過 48 小時連續監測 記錄，並計算 黑暗期（20:00–02:00）內的曲線下面積（AUC）。

• 每隻小鼠的代謝指標 取 兩個 24 小時測量週期的數據 計算 AUC 值，並 按照瘦體重（lean mass）進行標準化。

資料分析：

• 每小時代謝監測數據 以 均值 ± SEM 表示。

• AUC 量化數據 以 均值 ± SD 表示。

• 統計分析採用 單因素方差分析（ANOVA）和 Bonferroni 校正進行多重比較。

• *p < 0.05；**p < 0.005，UT 代表未處理組。

實驗結果表明：逆齡素可顯著改善老年小鼠的能量代謝，增強 VO₂ 和 VCO₂，並提高 EE，促進能量代謝恢復，從而緩解因衰老導致的代謝衰退，延緩衰老進程。

逆齡素可減少老年小鼠的脂肪堆積並改善葡萄糖穩態

身體成分分析（包括 全身脂肪和肌肉質量）可用於評估 個體健康狀況。

實驗結果表明（圖 3A-D）：

• 與 年輕（3 個月齡）WT 小鼠 相比，28 個月齡 Veh 處理 WT 小鼠 的 全身脂肪和內臟脂肪 顯著增加。

• 6 個月的膳食逆齡素治療 可 顯著減少老年小鼠的全身脂肪及內臟脂肪堆積（圖 3A、B）。

• 逆齡素治療 還可 減輕年齡相關的肌肉流失，提高老年小鼠的身體瘦肉百分比（圖 3C、D）。

• 體重變化 在 Veh 組與逆齡素治療組之間無顯著差異（圖 3E）。

脂肪減少與肌肉保護 在22至28個月大的小鼠中進行6個月的逆齡素治療後，我們觀察到顯著的代謝改善。Micro-CT分析顯示，與年輕（3個月）WT小鼠相比，接受Veh治療的老年（28個月）WT小鼠全身脂肪和內臟脂肪體積顯著增加，而逆齡素治療可有效減少這種與年齡相關的脂肪堆積（圖3A、B）。此外，逆齡素還能改善年齡相關的肌肉損失，提高瘦肉比例（圖3C、D），但總體體重無顯著變化（圖3E）。

血糖穩態的改善 年齡相關的血糖穩態受損和胰島素抵抗與肌肉質量下降密切相關。為了評估逆齡素對血糖穩態的影響，我們進行了葡萄糖耐量測試（GTT）和胰島素耐量測試（ITT）。儘管兩組小鼠的GTT和ITT無顯著差異（圖S6），但逆齡素治療組表現出更好的趨勢。重要的是，6個月的逆齡素治療可顯著降低空腹血糖水平（6小時）和GTT 120分鐘的血糖水平（圖3F、G）。

肝臟轉錄組分析 為了探討逆齡素改善血糖穩態的分子機制，我們進行了RNA測序分析。結果顯示，接受Veh治療的老年小鼠的肝臟胰島素信號相關基因表達發生顯著變化，影響胰島素信號、葡萄糖代謝、脂質代謝及細胞增殖/分化（圖S7A）。然而，逆齡素治療可逆轉這些變化，使基因表達水平趨向年輕小鼠（圖S7B-D）。此外，逆齡素降低了IKKβ的表達，該基因可抑制胰島素信號並導致胰島素抵抗（圖S7B）。

糖原代謝調控 在糖原代謝方面，肝糖原分解相關的關鍵酶（Agl、Pygl、PKAα和PhKδ）在老年Veh治療小鼠中顯著上調，而逆齡素治療可抑制這些酶的表達（圖3H、I），從而減少肝糖分解，改善血糖穩態。類似地，與糖原合成相關的酶（Gys2、Gbe1、Gsk3β和PP1）在老年Veh治療小鼠中顯著上調，而逆齡素治療可使其恢復至年輕小鼠水平（圖3I，圖S7E、F）。

綜上所述，逆齡素可改善老年小鼠的身體成分，減少脂肪堆積，並保留瘦體質量，從而可能有助於維持健康老齡化。

逆齡素可抑制老年小鼠的肌肉衰老

肌少症與粒線體功能 肌少症的特徵是肌肉質量和力量的下降，伴隨粒線體功能受損。為了研究逆齡素的抗肌肉衰老作用，我們評估了逆齡素治療對老年小鼠骨骼肌功能與結構的影響。轉棒測試結果表明，逆齡素治療可顯著改善26個月大WT小鼠的運動能力（圖4A）。

組織學分析 Masson三色染色分析顯示，26個月大的Veh治療小鼠的肌纖維明顯萎縮並伴有纖維化，而逆齡素治療可顯著緩解這些衰老相關的肌肉病理變化（圖4B）。此外，逆齡素治療組的股四頭肌和腓腸肌中的肌纖維面積明顯增加，纖維退行性變化減少（圖4C-E），表明逆齡素可有效改善肌肉健康。

在老年野生型小鼠（n=4-7）中，給予飲食中添加逆齡素（100 毫克/公斤/天）或對照食物，分別治療 3 個月和 6 個月（從 20 個月齡開始），隨後進行 Rotarod 運動能力測試（圖 4A）。

為了評估肌肉組織結構的變化，我們採用 Masson 三色染色法分析股骨和腓腸肌（圖 4B）。21 個月齡的野生型小鼠在飲食中攝取逆齡素後，我們觀察到股骨和腓腸肌中的肌纖維完整性有所改善（圖 4C）。此外，肌纖維完整性和損傷形態的量化分析進一步證實了這一點（圖 4D, E）。所有數據均以均值 ± 標準差（SD）表示，統計檢驗採用 Bonferroni 單因子方差分析（ANOVA，圖 4D, E）或學生 t 檢驗（圖 4A）；* p < 0.05，** p < 0.005。

透射電子顯微鏡（TEM）分析進一步揭示了逆齡素對腓腸肌超微結構的影響（圖 4F-H）。3 個月大的幼鼠（圖 4F）顯示完整的肌原纖維結構，而 24 個月大的對照小鼠（接受 Veh 處理）表現出明顯的粒線體變性（MD）和嚴重纖維化（*），這些可能由肌原纖維變性（Z 線錯位，ZLb）引起（圖 4G）。

令人驚訝的是，接受 3 個月逆齡素治療的小鼠表現出超微結構的恢復，包括完整的 Z 線（ZL）和多個正常大小的三聯體（圖 4H）。這表明逆齡素治療可有效緩解與衰老相關的肌肉退行性變，甚至在一定程度上逆轉其進程。圖 4H 中顯示的完整 Z 線和正常的三聯體結構，進一步支持逆齡素促進肌肉年輕化的假設。標註：M（粒線體），SR（肌漿網），TC（SR 終池），比例尺 500 nm。

綜上所述，逆齡素治療可通過改善脂肪積累、增強肌肉質量、恢復血糖穩態及調節糖原代謝，顯著延緩老年小鼠的代謝衰退與肌肉衰老，具有潛在的抗衰老應用價值。

逆齡素可中斷老年小鼠的心臟老化

隨著年齡增長，老年群體中心血管疾病的發生率顯著增加，但目前尚無有效的治療手段。人類心臟老化的主要特徵包括射血分數（EF）下降、心臟功能指數（HFI）上升、心律失常發生率增加以及血管周圍纖維化加重。

在本研究中，我們利用超聲心動圖（評估機械功能）、心電圖（ECG，評估電功能）和組織病理學分析，對 24 個月齡接受 Veh 處理的野生型小鼠心臟老化表型進行了系統評估（圖 5）。

實驗結果表明，逆齡素可改善老年心臟的機械功能，顯著提高收縮期射血分數（EF）並降低舒張期心肌功能指數（圖 5A, B）。

為了進一步探討逆齡素對年齡相關心律不整和心臟電生理的影響，我們記錄了連續 5 分鐘的 ECG 訊號。令人驚訝的是，逆齡素顯著減少了老年小鼠的心律不整發生率（圖 5D），並修正了自然老化突變小鼠中觀察到的 QT 間期異常（圖 5E）和 Tpeak-Tend 間期異常（圖 5F）。

此外，為了評估心臟組織的結構變化，我們利用天狼星紅/快速綠色染色來檢測膠原蛋白的沉積。結果顯示，逆齡素治療顯著減少了老年小鼠心臟的血管周圍纖維化（圖 5G）。

實驗結果表明，逆齡素能夠有效減緩老年野生型小鼠的心臟老化進程。超音波心動圖分析（圖 B、C）顯示，與對照組相比，逆齡素治療組的射血分數（EF）和左心室功能指數均有所改善。此外，心電圖分析（圖 D）揭示，未接受治療的老年小鼠或對照組（Veh）小鼠表現出明顯的心律失常，包括期前收縮（VPC）、房室傳導阻滯（AV 阻滯）、PR 間期不規則以及 QT 間期延長，而逆齡素治療顯著緩解了這些異常（圖 E、F）。

為了進一步評估逆齡素對心臟結構的保護作用，我們使用天狼星紅/快綠染色（圖 G）檢測心臟血管周圍的纖維化情況，結果表明，逆齡素治療組的膠原蛋白沉積較對照組顯著減少，提示其可能具有抗纖維化作用。透射電子顯微鏡（TEM）分析（圖 H-K）進一步揭示，未經治療的 24 個月齡老年小鼠（圖 I、J）表現出顯著的線粒體變性、肌原纖維斷裂及細胞間連接（ICD）結構異常，而經過 3 個月逆齡素治療後（圖 K），這些超微結構損傷得到明顯修復，與 3 個月齡幼鼠（圖 H）的心肌超微結構相似。

實驗採用 21 個月齡 WT 小鼠模型，以 100 mg/kg/天 的劑量給予逆齡素或對照（Veh）處理 3 個月，並在 24 個月齡時進行分析。所有定量數據均以均值 ± 標準差（SD）表示，並採用單因素方差分析（ANOVA）及 Bonferroni 校正進行統計檢驗。顯著性水平設定為 *p < 0.05；**p < 0.005。

綜上所述，本研究表明，逆齡素不僅能夠抑制老年小鼠的被奪走的衰老，還能夠改善其心臟功能，減弱與年齡相關的心律異常和心臟纖維化，具有潛在的抗衰老治療價值。

逆齡素改善了土地超微結構

在超微結構層面，逆齡素可有效改善心肌細胞間盤（ICD）、粒線體和肌節的老化相關傷害。 ICD 負責維持心肌細胞間的機械耦聯和電信號傳遞，其結構完整性對於心臟功能至關重要。透射電子顯微鏡（TEM）觀察顯示，3 個月齡 WT 小鼠的 ICD 結構完整（圖 5H），而 24 個月齡對照組小鼠（圖 5I、J）則表現出嚴重的超微結構異常，包括黏著斑（FA）破壞、間隙連接（GJ）斷裂、橋粒（DS）部分撕裂，以及 ICD 兩側間隔增寬。此外，老年小鼠心肌細胞內可見顯著的粒線體腫脹、破裂及肌原纖維萎縮。然而，接受 3 個月逆齡素治療後（圖 5K），這些結構異常得到明顯改善，ICD 結構恢復完整，粒線體形態及肌原纖維排列接近 3 個月齡小鼠的水平。

綜合來看，這些結果表明，在自然老化的小鼠中，逆齡素可有效改善心臟的電生理功能，並延緩心臟老化進程。

逆素齡透過 Cisd2 依賴途徑發揮抗衰老作用

本研究發現，逆齡素對衰老及相關表型的改善作用在很大程度上依賴於 Cisd2。為了驗證這一假設，我們使用 Cisd2 mcKO 小鼠（MCK-Cre；Cisd2^f/f），該模型特異性敲除 Cisd2，影響其骨骼肌和心肌功能。結果顯示，Cisd2 mcKO 小鼠在 3 個月大時即表現出明顯的早衰特徵，並且壽命縮短，其衰老表型與 26 個月齡的 WT 小鼠相當。

為了進一步評估 Cisd2 在逆齡素抗衰老作用中的重要性，我們從 3 個月齡開始，對 Cisd2 mcKO 和 WT 小鼠分別給予逆齡素或對照（Veh）治療 4 個月，並在 7 個月齡時進行分析（附加文件 ：圖 S8A）。檢測結果表明，WT 組和 Cisd2 mcKO 組小鼠的血清及各組織（包括肝臟、骨骼肌和心肌）中的逆齡素濃度無顯著差異（附加文件 ：圖 S8B）。

在 WT 小鼠的骨骼肌功能檢測中，轉棒測試和組織病理學分析表明，無論接受逆齡素或對照（Veh）治療，其肌肉功能和結構均保持正常，說明逆齡素對年輕的 WT 小鼠沒有顯著影響（附加文件 ：圖 S8C、D）。然而，在 Cisd2 mcKO 小鼠 中，逆齡素未能改善其肌肉功能或逆轉組織病理學損傷（附加文件 ：圖 S8C、D）。Cisd2 mcKO 小鼠的骨骼肌表現出明顯的退行性變化，包括肌纖維收縮、圓形纖維增多等病理特徵（附加文件 ：圖 S8D）。

同樣，在 Cisd2 mcKO 小鼠的心臟 中，逆齡素未能改善其電生理異常（即心律失常）或減少心肌損傷和纖維化（附加文件 ：圖 S9A–C）。這些結果表明，Cisd2 的存在對於逆齡素髮揮其心臟和骨骼肌的抗衰老作用至關重要。

為了進一步區分逆齡素的 Cisd2 依賴性 和 非依賴性 作用，我們對以下四組小鼠的骨骼肌組織進行 RNA 測序分析：WT-NLS、WT-Veh、Cisd2 mcKO-NLS 和 Cisd2 mcKO-Veh（圖 6A）。

差異表達基因（DEG）分析 顯示，在 WT 小鼠中，91 個基因受到逆齡素調控（62 個上調基因，29 個下調基因），其中 79%（72/91）為 Cisd2 依賴性基因，21%（19/91）為 Cisd2 非依賴性基因（圖 6B、C）。這表明，逆齡素的大部分基因調控作用依賴於 Cisd2，當 Cisd2 缺失時，這些基因的差異表達模式消失。

儘管如此，仍有 21% 的 DEG 在 Cisd2 mcKO 小鼠中仍然保持差異表達（圖 6C），表明 逆齡素在一定程度上也具有 Cisd2 非依賴性作用。進一步的生物信息學分析（圖 6D）揭示，Cisd2 依賴性 DEG 主要涉及線粒體功能（53/72，73.6%）和鈣離子穩態（13/72，18.1%），這與 Cisd2 在維持線粒體健康及細胞內鈣平衡中的關鍵作用相一致。

綜上所述，本研究透過遺傳學和轉錄組學證據表明，逆齡素的抗衰老作用主要透過活化 Cisd2 來實現，其機制與粒線體功能調控和細胞穩態維持密切相關。

逆齡素治療4個月後的 Cisd2 依賴和非依賴 DEG

為了進一步探索逆齡素在衰老過程中對基因表達的影響，我們對 3 個月大 WT 和 Cisd2 mcKO 小鼠 的 腓腸肌 進行了 RNA 測序分析。這些小鼠接受了膳食逆齡素（100 mg/kg/天）或對照（Veh）食物治療 4 個月，在 7 個月大時犧牲。分析了以下四組小鼠：WT-逆齡素、WT-Veh、Cisd2 mcKO-逆齡素 和 Cisd2 mcKO-Veh。

B 圖 顯示，針對所有受逆齡素影響基因的主要成分分析（PCA），我們在 WT-Veh 和 WT-逆齡素組之間共識別出 91 個差異表達基因（DEG），其中 62 個為上調基因，29 個為下調基因（FDR < 0.2）。這些 DEG 進一步被分為 Cisd2 依賴性基因（72/91，79%） 和 Cisd2 非依賴性基因（19/91，21%）。

對 Cisd2 依賴性 DEG 和非依賴性 DEG 的協同分析結果顯示，在 Cisd2 mcKO 小鼠 中，Cisd2 依賴性 DEG 在逆齡素治療組和對照組之間無顯著變化（mcKO-逆齡素 vs mcKO-Veh，p > 0.05），而 Cisd2 非依賴性 DEG 則在逆齡素治療組和對照組之間表現出顯著差異（mcKO-逆齡素 vs mcKO-Veh，p < 0.05），提示 逆齡素的效應主要依賴於 Cisd2 的存在。

D 和 E 圖 展示了 Cisd2 依賴性和非依賴性 DEG 的通路分析結果。Cisd2 依賴性 DEG 主要涉及與 蛋白質合成、線粒體功能、細胞氧化應激 及 細胞死亡 相關的通路，而 Cisd2 非依賴性 DEG 主要涉及 代謝調節和細胞反應途徑，這些結果進一步揭示了逆齡素通過調節多條重要的生物學通路來發揮抗衰老作用。

逆齡素治療使轉錄組模式更接近年輕狀態

為深入瞭解逆齡素對衰老的影響，我們還對 心肌和骨骼肌 進行了RNA測序，並進行了三組對比分析：（組1）26 個月 WT-Veh 與 3 個月 WT；（組2）26 個月 WT-Veh 與 26 個月 WT-逆齡素；（組3）26 個月 WT-逆齡素 與 3 個月 WT。我們設置 FDR < 0.1 作為顯著性閾值。

從這三組 DEG 中，我們選擇了 組1 中因自然衰老而表現出顯著表達變化的基因。接著，使用 組2，進一步選擇那些通過逆齡素治療恢復的基因；最後，使用 組3，選擇那些在 3 個月大 WT 小鼠和用逆齡素治療的 26 個月大 WT 小鼠之間沒有顯著差異表達的基因。

GO 分類分析 表明，在 心臟 和 遠端骨骼肌 中，逆齡素能夠顯著逆轉衰老過程中發生的基因表達變化，且這些基因參與的生物過程和細胞成分相似（圖 7A）。這些共同的功能改變主要涉及代謝、蛋白質合成、線粒體功能、氧化應激、細胞死亡、免疫反應等重要的衰老相關通路。

在心臟（圖 7B、C）和骨骼肌（圖 7D、E）中，逆齡素顯著改善了衰老小鼠中排名前五的受影響通路。特別地，代謝調節、蛋白質合成、線粒體功能以及氧化應激相關通路均顯示出逆齡素的積極調節作用。此外，逆齡素還顯著降低了活性氧（ROS）和活性氮的水平，尤其是在 老年小鼠的腎臟和心肌中，其與 ROS 相關的 DEG 表達模式向年輕小鼠的表達模式轉變（附加文件 ：圖 S10、圖 S11、圖 S12）。

逆齡素對生物學過程和亞細胞定位的影響

為了進一步探討逆齡素對衰老的修復效果，我們基於 GO 註釋 對生物學過程和亞細胞定位進行了分析，使用 PANTHER 功能分類分析 GO。

B 圖 顯示，141 個 DEG（包括 126 個上調基因 和 15 個下調基因）在 逆齡素治療 後得到了顯著修復（26 個月 WT-Veh vs 3 個月 WT，FDR < 0.1）。這些基因的表達模式發生了顯著改變，且老年心臟的轉錄組模式向年輕心臟的模式轉變，進一步驗證了逆齡素的抗衰老效果。

C 图 展示了逆龄素修复的 老年心脏中的 DEG，这些 DEG 被分组到与年龄相关的不同通路，并以百分比形式表示。通过热图分析，我们发现逆龄素显著影响了心脏衰老过程中多个关键的生物学途径，并使这些途径的表达水平恢复至年轻状态。

D 圖 展示了逆齡素治療後，腓腸肌（衰老骨骼肌）中所有 41 個 DEG（包括 9 個上調基因 和 32 個下調基因）的修復結果（26 個月 WT-Veh vs 3 個月 WT，FDR < 0.1）。這些 DEG 的修復同樣表明，逆齡素能夠使衰老的骨骼肌表達模式向年輕肌肉的模式轉變，進一步支持了其抗衰老作用。

E 圖 展示了在 衰老骨骼肌 中被逆齡素修復的 DEG，這些 DEG 被進一步分組到與年齡相關的不同通路中，並按比例表示。所有這些結果均表明，逆齡素在多個衰老組織中都能有效恢復與年齡相關的生物學途徑，進一步展示其廣泛的抗衰老效果。

在本研究中，所有小鼠均從 21 個月大 開始接受膳食逆齡素（100 mg/kg/天）或對照（Veh）食物治療，直到 26 個月，並通過 MGI GO 術語查找器對數據進行分組和分析（p值 < 0.05）。這些數據為逆齡素的抗衰老作用提供了有力的支持，揭示了其通過調控關鍵的衰老相關路徑在不同組織中的修復作用。

討論

在本研究中，我們展示了 Cisd2 激活劑（逆齡素）能夠作為一種有效的轉化療法，促進衰老逆轉並延長健康壽命，尤其是在老年小鼠中。我們的研究揭示了三個關鍵發現：

首先，Cisd2 可以被小化合物激活，逆齡素作為其中一種激活劑，能夠有效提高 Cisd2 表達水平。我們發現，逆齡素在老年小鼠中的晚期治療能夠將 Cisd2 提升至接近年輕小鼠的水平。此增強的 Cisd2 表達似乎能延緩衰老過程，恢復衰老組織的活力，從而有助於延長健康壽命並促進長壽。

其次，逆齡素對與老化相關的多種結構性缺陷和功能完整性產生了顯著的益處。具體來說，逆齡素在老年小鼠中恢復了與年齡相關的全身能量耗竭、體內脂肪減少、肌肉損傷修復以及體重減輕恢復等問題。此外，逆齡素也延緩了心臟和骨骼肌的衰老進程，進一步表明其對全身健康恢復具有關鍵作用。

最重要的是，逆齡素的抗衰老作用是 Cisd2 依賴性 的。當 Cisd2 不存在時，逆齡素的作用顯著減弱，表明 Cisd2 在逆齡素作用中的關鍵作用。逆齡素的作用不僅僅是延緩衰老，還能促使老年組織的轉錄組模式向年輕小鼠的模式轉變，尤其在 基因表達、粒線體功能、氧化壓力、細胞死亡、免疫反應 和 衰老相關炎症 等生物學過程中均展現了類似年輕小鼠的特徵。

逆齡素與健康壽命延長

針對人類健康壽命延長的相關研究表明，儘管抗氧化劑、葉酸、B 族維生素以及多種維生素補充劑廣泛應用，但其在延長健康壽命方面的效果並不顯著。相反，一些動物模型的研究表明，抗氧化劑補充劑治療不僅未能顯著延長壽命，甚至可能有不良影響。然而，逆齡素作為一種天然黃烷酮苷元，表現出顯著的抗氧化效果，能夠通過清除活性氧（ROS）和減少過氧化作用而無細胞毒性。此外，逆齡素作為 過氧亞硝酸鹽（ONOO-） 清除劑，能夠有效抑制氧化反應並減少細胞損傷，具有明顯的抗衰老和抗癌作用。

先前的研究也表明，逆齡素在動物模型中能夠抑制多種化學誘導的癌症，如膀胱癌、乳腺癌等，並透過抑制心肌缺血和減弱心肌梗塞後的心肌纖維化，展現出對心臟的保護作用。在肝臟中，逆齡素也顯示出對糖代謝的調節作用，能夠改善代謝紊亂。

逆齡素作為CR類似物的替代方案

熱量限制（CR）被認為是唯一已知的非遺傳、非藥物干預方法，能夠延長壽命並延緩多種與年齡相關的疾病。CR 通過調節多條分子信號通路，如 胰島素/胰島素生長因子、sirtuins、AMP 激活蛋白 以及 mTOR 路徑，發揮其抗衰老效應。雖然幾種 CR 類似物（如白藜蘆醇、二甲雙胍和雷帕黴素）在研究中顯示出一定的潛力，但它們仍存在副作用，如長期使用雷帕黴素可能導致糖代謝紊亂，二甲雙胍也可能引發胃腸道不適。

相比之下，逆齡素作為一種 Cisd2 激活劑，能夠在不產生明顯副作用的情況下延緩衰老進程並改善與年齡相關的功能。我們的研究表明，逆齡素作為膳食補充劑，能夠在雄性小鼠的晚年階段安全使用，並有效改善其衰老相關的生理特徵。因此，逆齡素可能成為熱量限制（CR）類似物的一個有效替代品，為老年醫學提供了一種新的干預策略。

總的來說，本研究成功驗證了逆齡素透過活化 Cisd2 延緩老化並延長健康壽命的潛力，為抗衰老藥物開發和健康老化策略的研究提供了新的方向。

實驗結論

本研究首次驗證了 逆齡素 作為 Cisd2 激活劑 在抗衰老中的潛力，證明了其能有效延緩衰老過程。我們的研究結果為使用 Cisd2 作為分子靶點，篩選和開發能夠激活 Cisd2 的新型化合物提供了實驗依據。這為未來將這些化合物轉化為可應用於老年醫學的臨床治療方案奠定了基礎。

最重要的是，逆齡素在多個重要器官和組織中展現出了顯著的生物活性，尤其是在 骨骼肌、心臟 和 肝臟 等衰老相關組織中的效果。通過為期四個月的治療，逆齡素沒有在體內顯示出任何明顯的毒性反應，尤其是在劑量為 100 mg/kg/天 時，這相當於人類每天 491 mg/60 kg 的相應劑量，且無顯著副作用。

因此，將逆齡素開發為藥用或營養功能性食品具有巨大的潛力，特別是在預防衰老相關疾病和促進健康老齡化方面。其應用不僅可以延長健康壽命，還可能為治療與年齡相關的多種疾病提供新的策略。這一發現為未來開發基於 Cisd2 活化 的抗衰老藥物或補充劑開闢了新的前景。

縮寫

Agl：Glycogen debranching enzyme（肝醣去支鏈酵素）

BAC：Bacterial Artificial Chromosome（細菌人工染色體）

CBC：Complete Blood Count（全血球計數）

CR：Calorie restriction（熱量限制）

DEG：Differentially Expressed Genes（差異表達基因）

ECG：Electrocardiography（心電圖檢查）

EE：Energy expenditure（能量消耗）

FDR：False Discovery Rate（假發現率）

G1P：Glucose 1-phosphate（葡萄糖-1-磷酸）

G6P：Glucose 6-phosphate（葡萄糖-6-磷酸）

G6pc：Glucose-6-phosphatase alpha（葡萄糖-6-磷酸酶 α 亞型）

GO：Gene Ontology（基因本體論）

GTT：Glucose tolerance test

N7G：Nilingsu-7-O-beta-D-glucuronide（逆齡素-7-O-β-D-葡萄醣醛酸酯）

N7S：Nilingsu-7-O-sulfate（逆齡素–7-O-硫酸酯）

NLS： Nilingsu (逆齡素)

HPLC：High Performance Liquid Chromatography（高效能液相層析）

ICD：Intercalated disc（間隙盤）

ITT：Insulin tolerance test（胰島素耐受性測試）

mcKO：Skeletal and cardiac muscles tissue-specific knockout（骨骼肌和心臟肌肉組織特異性基因敲除）

MGI：Mouse Genome Informatics（小鼠基因組資訊學）

MGI：Mouse Genome Informatics（小鼠基因組資訊學）

PhK：Phosphorylase kinase（磷酸化酶激酶）

PKAα：Protein kinase A alpha（蛋白激酶A α 亞單位）

Pygl：Glycogen phosphorylase（糖原磷酸化酶）

ROS：Reactive oxygen species（活性氧種）

RPKM：Reads per kilobase of exon model per million reads（每百萬次讀取的外顯子模型每千鹼基讀取數）

TEM： Transmission electron microscopy（透射電子顯微鏡）

TG：Transgenic（基因改造）

VCO2 : Carbon dioxide production rate（二氧化碳產生速率）

Veh：Vehicle（載體）

VO2 : Oxygen consumption rate （氧氣消耗速率）

WT：Wild-type（野生型）

附加文件

圖 S1:

圖 S2:

圖 S3:

圖 S4:

圖 S5:

圖 S6:

圖 S7:

圖 S8:

圖 S9:

圖 S10:

圖 S11:

圖 S12: